馬鈴薯枯萎病拮抗菌的篩選與鑒定

李彩虹， 楊志輝， 張 岱， 趙冬梅， 潘 陽， 朱杰華

(河北農業大學植物保護學院，河北保定 071000)

馬鈴薯枯萎病是由茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、接骨鐮刀菌5種不同的鐮刀菌寄生所引起的一種真菌土傳病害[1]，分布廣泛，在我國各種植區均有發生，發病率達15%～45%[2]。近年來，隨著馬鈴薯主糧化戰略的實施，馬鈴薯種植面積逐年擴大，由此帶來的連作重茬導致馬鈴薯枯萎病日益加重，一般造成減產30%，嚴重時可造成78%的植株死亡，直接影響了馬鈴薯產量及其經濟效益，嚴重制約了我國馬鈴薯產業的發展[2-3]。

目前，馬鈴薯枯萎病的防治措施主要以農業防治和化學藥劑拌種為主，但由于該病為土傳病害，其病原菌抗逆性強且對植株為系統性侵染，使用藥劑防治效果較差，使用藥劑進行大面積的土壤處理可行性較小[3]。在缺乏有效化學藥劑和抗病品種的前提下，利用拮抗菌防治枯萎病是防治途徑之一，并且生防菌對環境、生態和人類健康安全，具有改善環境、獲得長期效益作用，符合現階段植物病害控制的發展方向[4]。

芽孢桿菌可以形成耐高溫、輻射、高酸堿等逆境的芽孢，能夠產生脂肽類和蛋白類等抗真菌物質，具有廣譜抗真菌活性和良好的穩定性，越來越為人們所關注。普遍認為芽孢桿菌生防機制主要有營養和空間位點競爭、抗菌物質產生、溶菌作用、誘導植物抗病性等[5]。目前，利用芽孢桿菌有益菌株拮抗植物鐮刀菌病害的研究已有較多報道，如黃瓜枯萎病[6]、香蕉枯萎病[7]、西瓜枯萎病[8]以及馬鈴薯干腐病[9]等，但針對馬鈴薯枯萎病開展的拮抗芽孢桿菌篩選的研究尚不多見，因此，進一步篩選出適合我國不同區域的芽孢桿菌菌株對于防治馬鈴薯枯萎病具有重要意義。

本研究從16個馬鈴薯枯萎病發生地塊的健康植株根際分離篩選出6株對馬鈴薯枯萎病病原菌有極強抗性的芽孢桿菌菌株，并對其中NZ-4菌株的抑菌譜進行了測定，旨在為馬鈴薯枯萎病的生物防治以及生防菌劑的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

從河北省保定、承德、張家口、秦皇島以及內蒙古自治區、貴州省的馬鈴薯枯萎病發病田塊中采集健康植株的根際土壤，采集深度范圍為10～20 cm，用無菌自封袋封好后帶回實驗室，暫保存于4 ℃，用于分離拮抗菌。

1.2 靶標病原菌

1株尖鐮孢馬鈴薯專化型菌株(Fusariumoxysporumf.sp. tuberosi，Y10-2)，由河北農業大學植物病理學實驗室提供。

1.3 培養基

細菌為LB培養基[10]，真菌為PDA培養基[11]。

1.4 芽孢桿菌菌株的分離和純化

采用熱處理土壤稀釋法[12]分離芽孢桿菌，連續劃線培養至純，以體積比1 ∶1混合于70%甘油中，-80 ℃冰箱保存備用。

1.5 拮抗菌的篩選

采用平板對峙法[13]測定芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌Y10-2的拮抗作用。初篩采用抑菌帶法，將接種平皿置于25 ℃恒溫培養箱內培養，以只接種病原菌的PDA平板為對照，待對照長滿平皿時，測量抑菌帶寬度并篩選出抑菌效果較好的菌株，采用抑菌圈法進行復篩試驗。

1.6 拮抗菌株的鑒定

采用菌落形態、革蘭氏染色與分子生物學相結合的方法對篩選到的拮抗菌株進行鑒定。

gyrB基因的序列分析：正向引物gyrB-F為5′-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3′；反向引物gyrB-R為5′-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3′[14]。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃ 終止反應。PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳上檢測后，送生工生物工程(上海)有限公司進行測序。將所測序列通過NCBI數據庫進行BLAST比對，利用Clustalx和MEGA 6.0[15]軟件對分離芽孢桿菌及模式菌進行系統發育分析。

1.7 拮抗菌抑菌譜測定

采用對峙培養法測定拮抗菌株對馬鈴薯炭疽病、馬鈴薯瘡痂病、小麥根腐病菌、梨黑斑病菌、蘋果斑點落葉病菌、番茄早疫病菌、紅腐病菌以及煙草疫霉菌等重要的農業病害病原真菌的抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離及拮抗菌株的篩選

從16份根際土壤中分離純化到對馬鈴薯枯萎病菌具有潛在拮抗作用的芽孢桿菌有288株。通過平板對峙法初篩獲得抑菌帶寬度≥3 mm的拮抗菌株188株，占所有菌株的 65.3%。其中，20株拮抗菌抑菌帶寬度達到5.7 mm以上。利用抑菌圈法繼續對20株拮抗菌進行復篩，獲得抑菌圈直徑>20.0 mm的拮抗菌6株(表1、圖1)。

2.2 芽孢桿菌的種類鑒定

2.2.1 形態學特征 拮抗菌菌落呈圓形、乳白色，菌落邊緣不整齊、表面有突起或褶皺，具有一定的粘附性，直徑為5 mm左右；4 d后可產生棕褐色色素。6株拮抗菌根據其菌落形態具體又可分為3類：NZ-4菌株為第1類，菌落中間為突起狀，邊緣褶皺明顯，顏色較暗；NZ-5、NZ-6、HC-Z-18為第2類，菌落中間突起部分有凹陷，似噴泉狀，邊緣較為整齊；HC-Y-5、HC-Y-16為第3類，菌落中間凹陷，似魚嘴狀，邊緣褶皺明顯，不整齊。6株拮抗菌菌體均為桿狀，長約 2 μm，單生，革蘭氏染色結果為陽性(圖2)。

表1 芽孢桿菌對尖孢鐮刀菌的抑制作用

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2同。

2.2.2 拮抗菌gyrB基因序列分析 測定了NZ-4等6個芽孢桿菌菌株的gyrB基因序列，其序列相同，為1個haplotype，長度為964～999 bp。將該序列在GenBank數據庫中進行Blast，并下載相似性高于98%的序列8條。以Bacillussubtilis(枯草芽孢桿菌)等為外群，同源序列比對后，獲得長度為 892 bp 的gyrB基因數據組，利用鄰接法構建了6個未知芽孢桿菌的系統發育樹(圖3)。該樹形成1個大分支，即解淀粉芽孢桿菌復合種，該大分支可分為3個末端分支，從上到下分別為Bacillusvelezensis、Bacillusamyloliquefaciens和解淀粉芽孢桿菌中的另外1個隱藏種。本研究中的6條序列均聚在第1個分支，將其鑒定為Bacillusvelezensis。

2.3 拮抗菌NZ-4的抑菌譜

將菌株NZ-4對8株病原菌株進行抑菌譜測定。結果顯示，菌株NZ-4對馬鈴薯炭疽病、瘡痂病的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到35 mm； 對小麥根腐病菌、梨黑斑病菌、蘋果斑點落葉病菌、番茄早疫病菌的抑菌圈直徑均在24 mm以上；對紅腐病菌也有一定的拮抗作用；但對煙草疫霉菌的拮抗作用不明顯(表2、圖4)。表明菌株NZ-4有比較廣的抑菌譜，可以考慮將其應用于除馬鈴薯枯萎病外的其他作物病害的生防研究。

3 討論

采用gyrB序列對比方法對NZ-4等6株芽孢桿菌菌株進行了系統發育分析，并結合傳統的形態觀察將它們鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)。系統發育分析主要依據與6株拮抗菌gryB基因序列同源性為99%的 DQ903176(GenBank登錄號)，該菌株同KY315726、KM603514和KR605463單獨聚為1個分支。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)是2005年由Ruiz-García等新命名的芽孢桿菌種[16]，DQ903176菌株屬于Bacillusvelezensis，該菌之前被認定為Bacillusamyloliquefaciens的后異形同義詞[17]，2015年，Dunlap等通過對BacillusvelezensisNRRL B-41580T進行比較基因組學和DNA-DNA雜交分析，否定了Bacillusvelezensis為Bacillusamyloliquefaciens的后異形同義詞，即Bacillusvelezensis為不同于Bacillusamyloliquefaciens的一個種[18]。因此，本研究將登錄號為DQ903176的菌株所在的分支界定為Bacillusvelezensis種群，并將6株拮抗菌鑒定為Bacillusvelezensis。

表2 拮抗菌株NZ-4對不同病原菌拮抗效果

貝萊斯芽孢桿菌是一種新型生防細菌，有關它的研究日益增多。有研究發現，該菌對棉花黃萎病病原菌大麗輪枝菌[19]、番茄灰霉病灰葡萄孢菌[20]等具有拮抗活性，該菌產生的β-葡聚糖酶可抑制楊樹紫紋羽病菌[21]，還有研究者將該菌制成生物制劑，可有效降低赤霉病和DON積累[22]。本研究從16個馬鈴薯種植地塊分離篩選得到6株貝萊斯芽孢桿菌，它們對馬鈴薯枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌都具有很強的拮抗活性，為貝萊斯芽孢桿菌在馬鈴薯枯萎病的生物防治上提供了新的科學依據。

芽孢桿菌的拮抗機制通常是由于它能產生生物活性物質[23-24]。芽孢桿菌產生的拮抗物質主要有細菌素、抗生素、細胞壁溶解酶、其他抑菌蛋白及揮發性抗菌物質等[25]。相關研究表明，芽孢桿菌產生的fengycin類和iturin類家族的脂肽類化合物在抑制真菌病害中起著重要作用，這些物質中的一些只抗相同或相近的有特異受體位點的種類[26]。Lee等研究發現，貝萊斯芽孢桿菌產生的bacillomycin D、fengycin和(oxy) difficidin等活性物質抑制病原菌[27]。本研究結果表明，NZ-4菌株對除馬鈴薯枯萎病以外的其他多種重要農業病害病原菌也能產生較強的拮抗作用，由此推測，NZ-4菌株可能產生多種不同的抑菌物質，亦或該菌株產生的抑菌物質有較廣的抑菌能力，具體活性物質成份還有待于進一步研究，以期為該菌株在生產實踐中更廣泛的應用提供理論基礎。