6個新疆地方梨品種S基因型鑒定

張校立， 艾沙江·買買提， 徐葉挺， 許 娟， 鄧 莉， 王繼勛

(新疆農業科學院園藝作物研究所/農業部新疆地區果樹科學觀測試驗站，新疆烏魯木齊 830091)

新疆地方梨品種屬于新疆梨系統。新疆梨系統是梨五大栽培系統之一，代表品種是著名的庫爾勒香梨(PyrusbretschneideriRehd)。庫爾勒香梨維吾爾語名乃西米提或乃西普提，蒙古語名為開登木，原產新疆庫爾勒地區，在新疆已有1 400多年的栽培歷史，其果實香味濃郁、皮薄肉脆、清甜爽口、細嫩多汁、耐貯藏性強，是新疆名特優果品之一。截至2016年，庫爾勒香梨種植面積達7.39萬hm2，產量達128.04萬t[1]，香梨產業已成為庫爾勒地區的主導產業。庫爾勒香梨自交不親和，S基因型為S22S28[2]，自交結實率低，需要配置授粉品種，但不同的授粉品種會對香梨果實產生顯著的花粉直感效應，突出表現為不同花粉授粉后果實萼片脫落或宿存，萼片脫落后的幼果發育成為“母梨”，萼片宿存的幼果發育成為“公梨”，二者不但外在品質果形上差異很大，而且內在品質和口感上也差異明顯，市場價格差異非常顯著。徐勝利等研究表明，選擇新疆梨作為授粉品種能夠明顯改善香梨果形和果實品質[3]。鑒定新疆地方梨品種S-等位基因對庫爾勒香梨合理授粉品種的選配具有重要的理論意義。梨自交不親和性基因的研究始于20世紀50年代，國外最早研究的是Kikuchi、Machida等日本學者，采用廣泛的田間授粉雜交試驗，從日本梨中鑒定了7個S等位基因，命名為S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7[4-6]。國內最早研究的是烏云塔娜，2003年，從中國白梨中分離鑒定了7個新的S基因，分別記為S17、S19、S20、S21、S22、S26、S27等位基因[7]。譚曉風等分別從白梨、沙梨及秋子梨等亞洲梨種群分離鑒定了34個S等位基因[8]。從2003年開始至今采用PCR-RFLP、DNA測序、雜交檢測等方法開展了中國梨自交不親和性的研究，發現了包括S1～S10基因在內的42個S基因，從中國梨中克隆了S12、S13、S15、S17～S22、S25～S30、S32、S34、S35、S38～S40、S42、S46等S基因全長cDNA序列，確定了近500個梨品種的S基因型。近500個品種中大部分都是白梨系統、秋子梨系統、沙梨系統的品種，新建梨系統的品種非常少，目前，只有陳慧等鑒定了黃句句(S22S34)、伊犁紅句句(S22S28)、早熟句句(S17S19)、乃希木特阿木提(S19S28)、沙01號(S22S28)、斯爾克甫梨(S22S28)、墨梨(S26Sb)、貴德長把(S19Sb)等8個新疆梨系統品種S-基因型[9]。新疆梨地方品種是我國特有的梨樹資源，新疆地方梨品種S基因型的鑒定研究比較少，大部分新疆地方梨品種的S基因型還未鑒定，我們研究的6個新疆地方梨品種的基因型目前尚未有人報道。我們利用DNA測序技術鑒定了6個新疆地方梨品種的S基因型。6個品種S基因型的鑒定，以期豐富我國梨品種S基因型信息；為庫爾勒香梨篩選最佳的授粉梨品種提供理論基礎，并可為庫爾勒香梨的豐產栽培技術提供科學依據，也為香梨品種的遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種為褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨、庫爾勒黃酸梨、奎克阿木特2號、也歷克阿木特。品種均來自新疆農業科學院輪臺國家果樹資源圃。于2017年4月上旬采集各品種幼嫩葉片置于液氮中，帶回實驗室后于-80 ℃冷凍保存。

1.2 試劑

ExTaq、pMD18-T Vector、DNA回收試劑盒，購自北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司；DNA提取試劑盒，購于天根科技生化有限公司；其他藥品均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3 基因組DNA提取

參照植物基因組DNA提取試劑盒說明書(柱式植物DNAout2.0，天根科技生化有限公司)提取梨基因組DNA，在1%瓊脂糖凝膠、1×TAE緩沖液、3～5 V/cm下電泳，電泳結果用上海復日FR-980凝膠圖成像系統照相，檢測DNA樣品。

1.4 PCR擴增及檢測

根據已報道的梨的S基因相關信息，獲知梨S基因的一級結構由5個保守區、1個高頻可變區及1個內含子組成。高頻可變區是花粉識別的部位。S基因多態性主要源于高頻可變區的差異，通常根據高頻可變區的差別判斷不同的S基因。因此，根據S基因一級結構特點，利用S基因高變區(hypervariable region，HV)的保守序列設計合成引物。

正向引物PF：5′-TTTACGCAGCAATATCAG-3′；

反向引物PR：5′-AC(A/G)TTCGGCCAAATAATT-3′。

在江南等擴增反應體系及反應過程[10]的基礎上略作調整，使用ExTaq酶保證擴增結果的可靠性，擴增產物在1.4%瓊脂糖凝膠上于100 V電泳30～45 min，上海復日FR-980凝膠圖像系統分析拍照并記錄分析。

1.5 PCR產物回收、克隆、測序

利用凝膠回收試劑盒回收目的DNA片段，與PEASY-T5載體16 ℃條件下過夜連接，連接產物轉化至感受態大腸桿菌Trans1-T1，涂于SOC/Amp50固體培養基上37 ℃過夜。挑選陽性克隆，菌液PCR篩選帶有目的片段長度的克隆。每個S基因片段挑選3個陽性克隆，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果利用Blast與GenBank中已知的S-RNase基因序列比較，確定其S基因型。

2 結果與分析

2.1 S基因特異性擴增

采用S等位基因特異性引物PF和PR對6個梨品種基因組DNA進行PCR擴增，瓊脂糖電泳檢測結果見圖1。

從圖1可以看出，每個梨品種擴增都得到2條S基因特異片段，大約在300～1 500 bp。褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨、奎克阿木特2號、也歷克阿木特等5個品種都擴增出明顯的2條帶；庫爾勒黃酸梨擴增出來的2條帶不是太明顯，說明這個品種的S等位基因片段大小相差很小。

2.2 梨品種PCR擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離

將PCR擴增產物進一步進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，PCR產物在聚丙烯酰胺凝膠上電泳隨遷移率的不同，表現為不同位置的條帶。從圖2可以看出，6個品種在聚丙烯酰胺凝膠上均呈現2條明顯的條帶，褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨、奎克阿木特2號4個品種的2條帶都在300～500 bp之間；褐色句句梨、霍城冬黃梨的1條約450～500 bp 之間的擴增條帶在聚丙烯酰胺凝膠上的位置相同，它們的S基因的堿基序列是否相同有待進一步分析；也歷克阿木特的1條帶在1000～1 500 bp內，另1條帶在600～1 000 bp 內。

2.3 梨品種S基因型的鑒定

聚丙烯酰胺凝膠電泳后回收目的條帶，將克隆后的陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，將12條測定的結果序列使用生物信息學軟件進行Blast搜索、同源性比較，根據分析GenBank內S基因的堿基序列及同源性，確定6個新疆地方梨品種的S基因型。從表1可以看出，6個品種中S基因的核苷酸序列與GenBank中已登錄的梨S基因有極高的同源相似性，褐色句句梨的S基因與S28、S4基因的相似性達98%、99%；霍城冬黃梨的S基因與S28、S4基因的相似性達100%、99%；八月梨S基因與S28、S4基因的相似性達99%、100%；庫爾勒黃酸梨的S基因與S22、S35基因的相似性達100%、100%；奎克阿木特2號的S基因與S4、S16基因的相似性達100%、100%；也歷克阿木特S基因與S18、S12基因的相似性達94%、100%。

表1 6個新疆地方梨品種的S基因型

注：系統為新疆梨；引物為PF/FR。

3 討論與結論

本研究應用PCR技術和對S基因特異性擴增條帶的測序，通過DNA序列分析確定了6個新疆地方梨品種的S基因型。鑒定結果為：褐色句句梨S28S4、霍城冬黃梨S28S4、八月梨S28S4、庫爾勒黃酸梨S22S35、奎克阿木特2號S4S16、也歷克阿木特S18S12。同為新疆地方梨品種，它們之間既有相同之處，也有不同之處，如褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨等3個品種具有相同的基因型S28S4，這3個品種間不能相互作授粉品種，因為它們具有相同的基因型，如果相互間作授粉品種，就會出現不結果或結果率極低；庫爾勒黃酸梨、奎克阿木特2號、也歷克阿木特3個品種的基因型不相同，這3個品種間可以相互作授粉品種。褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨3個品種具有相同的基因型，并且都具有庫爾勒香梨的S28，庫爾勒黃酸梨具有庫爾勒香梨的S22基因，表明褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨、庫爾勒黃酸梨與庫爾勒香梨在起源上相關性比較大，奎克阿木特2號、也歷克阿木特與庫爾勒香梨在起源上相關性比較小。鑒定出的6個新疆地方梨品種分別含有S4、S12、S16、S18、S22、S28、S35等S基因，這些基因分別屬于白梨系統、沙梨系統和西洋梨系統的S基因，初步推論新疆地方梨品種可能是白梨系統、沙梨系統和西洋梨系統的雜種，雜種后代又經過長期的自然雜交，互相演化而來成現在的品種。在果樹育種學上，沈德緒等認為，新疆梨可能是西洋梨與白梨的雜交種[11]。新疆地方梨品種具體的起源與分類還需對其更多品種的S-基因進行鑒定，并需要進一步的分析與研究。

6個新疆地方梨品種基因型的鑒定，增加了我國6個新疆梨品種的S基因型信息，可為庫爾勒香梨授粉品種的篩選新疆地方梨品種提供理論依據。褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨3個品種具有庫爾勒香梨的S28基因，庫爾勒黃酸梨具有庫爾勒香梨的S22基因，表明褐色句句梨、霍城冬黃梨、八月梨和庫爾勒黃酸梨不太適宜作庫爾勒香梨的授粉品種；奎克阿木特2號與也歷克阿木特可以作為庫爾勒香梨的授粉品種，但其授粉后對庫爾勒香梨品質的影響，還需開展進一步研究。