烏拉爾圖小麥PBF基因克隆及其序列分析

胡喜貴， 吳曉軍， 姜小苓， 王玉泉， 李 淦， 胡鐵柱， 茹振鋼

(河南省現代生物育種協同創新中心/河南科技學院小麥研究中心，河南新鄉 453003)

DOF(DNA-binding with one finger)蛋白是植物特有的一類轉錄因子，在植物生長發育過程中起著重要作用[1]。DOF蛋白一般由200～400個氨基酸組成，包括2個主要結構域：N-端DNA結合高度保守結合域(DOF Domain)和C-端轉錄調控域[2]。醇溶蛋白盒結合因子(prolamin-box binding factor，PBF)屬于DOF蛋白家族之一，是胚乳組織特異的基因表達調控因子，主要調控作物籽粒中貯藏蛋白基因表達，最終影響貯藏蛋白的積累量[3]。目前已在玉米、水稻、大麥等禾本科作物中，廣泛開展了PBF基因調控功能研究[4-6]。Mena等利用大麥PBF基因同源性，首次克隆出小麥PBF編碼基因[5]。該基因被定位于普通小麥(TriticumaestivumL.，AABBDD，2n=6x=42)第5號同源群(5A、5B和5D)的著絲粒附近，并在小麥胚乳的整個發育過程中持續表達[7]。

普通小麥是異源多倍體物種的一個典型代表，其A、B和D染色體組分別由烏拉爾圖小麥(TriticumurartuTum. AA，2n=2x=14)、擬斯卑尓脫山羊草(AegilopsspeltoidesTausch. SS，2n=2x=14)和節節麥(AegilopsTauschiiCoss. DD，2n=2x=14)提供[8-12]。由于異源多倍化以及長期馴化的過程，現代普通小麥的遺傳多樣性較其祖先種大大降低[13]。Ravel等對27個普通小麥研究證實，普通小麥的PBF等位基因(wPBF-A、wPBF-B和wPBF-D)多樣性較低[14]。因此，發掘普通小麥祖先種PBF基因的種質資源，將對小麥品質改良具有重要意義。截至目前，節節麥PBF基因已有報道[15]，但其他2個祖先種的PBF基因尚未見報道。本研究擬對2份烏拉爾圖小麥材料進行PBF基因克隆并分析其序列結構特征，以期為進一步研究烏拉爾圖小麥PBF基因調控功能、改良普通小麥品質等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗2份烏拉爾圖小麥材料(TriticumurartuTum.)PI428225(土耳其)和PI428269(黎巴嫩)，均由美國種質資源庫(National Genetic Resources Program，NPGS)饋贈，經河南科技學院小麥中心繁殖并保存。

1.2 引物設計

根據NCBI數據庫中烏拉爾圖小麥G1812的全基因組鳥槍法測序數據(登錄號：KD091395)，設計1對覆蓋PBF基因完整編碼區的特異性引物：PBF-F(5′-ATTCGATATGTGT-GTACACATGT-3′)和PBF-R(5′-TCTTGCACTTACATCA-GGGAG-3′)，其引物由Thermo Fisher Scientific InvitrogenTM公司合成。

1.3 基因克隆與測序

2份烏拉爾圖小麥材料進行室溫發苗，培養7 d左右，取幼嫩葉片備用。參照Yan等的2×CTAB方法[16]，提取基因組總DNA。采用高保真TransStart?Fast Pfu DNA聚合物(TransGen Biotech，中國北京)進行PBF基因擴增。其PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。擴增產物用1.0%瓊脂糖進行電泳分離，切取目的條帶，經PUEX Gel DNA回收試劑盒(Bioche，中國北京)純化，與pEASY克隆載體(pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit，TransGen Biotech，中國北京)連接。經轉化、篩選、挑取3個陽性克隆，送華大基因公司(BGI，中國深圳)測序。

1.4 序列分析

經測序分析，獲得烏拉尓圖小麥PBF基因DNA序列。利用NCBI的Blastn工具進行在線序列比對，判斷其屬性。同時，搜索與其同源的核苷酸及氨基酸序列。利用DNAMAN(Ver.7.0)進行多序列比對處理，DNASP(Ver.5.10.01)分析序列的多態性位點；利用NLStradamus(http：//www.moseslab. csb.utoronto.ca/NLStradamus/)和MyHits (http：//myhits.Isb-sib.ch/)分別進行蛋白核定位信號和翻譯后修飾位點在線預測。運用MEGA Ver 4.0中的鄰接法(neighbor joining method，NJ)構建聚類樹。

2 結果與分析

2.1 烏拉爾圖小麥PBF基因克隆

利用設計引物PBF-F和PBF-R對2份烏拉爾圖小麥PI428225和PI428269的基因組DNA進行PCR擴增，其擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，2份材料均擴增出長度為 1 000 bp 左右的單一條帶(圖1)。將目的片段回收、純化，連接到pEASY克隆載體上，經測序分析后，2份材料的條帶核苷酸序列長993 bp，對應GenBank數據庫登錄號為MF547409(PI428225)和MF547410(PI428269)。

2.2 烏拉爾圖小麥PBF基因核酸序列比對分析

利用DNAMAN軟件進行序列多重比對，表明，本研究克隆烏拉爾圖小麥得到2個PBF基因的核苷酸序列(MF547409和MF547410)，與已報道烏拉爾圖小麥(EMS61761)、節節麥(KJ544771和KJ544772)和普通小麥中國春(KC849701、KC849702和KC849703)的PBF基因具有相同的長度(993 bp)，一致性高達97.35%。但是，相比不同來源PBF基因序列分析發現，烏拉爾圖小麥PBF存在豐富變異位點，高達45個單核苷酸多態性位點(SNPs)(圖2)。在45個SNPs中，30個轉換(transitions)位點包括18個G←→A(90、312、423、441、444、462、463、489、504、648、708、718、768、827、857、883、926、951)和12個C←→T(271、313、392、502、513、578、614、654、687、735、861、888)，15個顛換(transversions)位點包括3個T←→A(14、573、590)、3個T←→G(64、635、800)和9個C←→G(68、285、336、366、713、794、891、911、980)。

對烏拉爾圖小麥3個PBF基因的核苷酸序列比較分析發現，共存在6個突變位點。其中，已報道的EMS61761序列中有4個位點，分別是第59、第249位點的C→T、第393位點A→T、第514位點G→A；本研究的MF547410序列中僅存在2個位點，是第825、第938位點的C→T。可見，烏拉爾圖小麥的PBF基因是相對保守的。

2.3 烏拉爾圖小麥PBF基因氨基酸序列比對分析

對根據烏拉爾圖小麥、節節麥和普通小麥中國春的PBF基因推導的氨基酸序列進行比較發現，它們具有相同長度330個氨基酸(aa)，并具有相似的結構特征，均含有蛋白核定位信號保守序列KKPR(NLS core)，N-端保守的DOF結構域(DOF domain)，C-端可變的調控區域具有典型的富天冬酰胺(asparagine-rich)序列特征，以及連接N-端結構域和 C-端調控域的絲氨酸殘基鏈(ser hinge)(圖3)。但相比節節麥、普通小麥中國春的PBF氨基酸序列，烏拉爾圖小麥PBF氨基酸序列發現22個氨基酸變異位點(圖3)，主要歸因于核苷酸序列上堿基的替換(轉換和顛換)(圖2)。其中，7個變異位點(5、22、23、91、95、105、131)分布于N-端DOF結構域之外；15個變異(155、193、197、205、212、238、240、265、267、276、286、295、304、309、327)分布于C-端調控區域。

MyHits分析PBF氨基酸序列，共存在3種類型的修飾位點，其中，N-端糖基化位點(ASN-glycosylation site)均有4個，1個位于N-端保守的DOF結構域，其余3個集中分布于C-端調控區域末端；酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(CK2-phospho-site)均有5～6個，分布于整條PBF氨基酸序列上；蛋白激酶C磷酸化位點(PKC-phospho-site)均有2個，分別位于N-端保守的DOF結構域和C-端富天冬酰胺區域。進一步分析發現，烏拉爾圖小麥PBF氨基酸序列存在特有1個酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點(CK2-phospho-site)，該位點因第22、第23位點2個氨基酸變異(A→S和G→A)形成，這一特征顯著區別其他來源序列(圖3)。

2.4 聚類分析

NCBI數據庫中有17個PBF序列：普通小麥中國春，KC849701、KC849702和KC849703；節節麥，KJ544771和KJ544772；烏拉爾圖小麥，EMS61761；黑麥(Secalecereale)，KJ747373～KJ747377；大麥(Hordeumvulgare)，AJ000991和AK375168；玉米(Zeamays)，BT035326和BT062957；水稻(Oryzasativa)，AF480496和CM000127和本研究的2個烏拉爾圖小麥PBF序列構建的聚類樹(圖4)，19個PBF序列被清晰地分成2組(GroupⅠ和Group Ⅱ)。在第1組(Group Ⅰ)中，15個PBF序列被進一步分為3個亞組，即來源于大麥PBF亞組、來源于黑麥PBF亞組、來源于普通小麥及供體祖先種(節節麥和烏拉爾圖小麥)PBF亞組。

3 討論與結論

Ravelc等對27個普通小麥PBF基因研究發現，wPBF-A、wPBF-B、wPBF-D等位基因分別存在1、5、1個單核苷酸多態性位點(SNPs)，其結果表明普通小麥中PBF基因遺傳多樣性較低[14]。本研究從2份烏拉爾圖小麥材料克隆出PBF基因(MF547409和MF547410)核苷酸序列與NCBI數據庫中烏拉爾圖小麥PBF基因序列(EMS61761)具有較高一致性，僅存在6個突變位點。然而，相比節節麥和普通小麥中國春PBF基因， 烏拉爾圖小麥PBF存在豐富變異位點，高達45個單核苷酸多態性位點(SNPs)(圖2)，表明烏拉爾圖小麥PBF基因具有較高遺傳多樣性。聚類分析顯示，來源于烏拉爾圖小麥與普通小麥的PBF聚在1個亞組(圖4)，證實了二者親緣關系較近[10]。同時，又進一步印證了PBF蛋白在物種間存差異且親緣關系越遠，其差異越大，即PBF蛋白表現為種屬特異性[15]。

DOF是植物特有的轉錄因子家族，典型的DOF蛋白由200～400個氨基酸組成，其N-端有高度保守的DOF結構域和C-端轉錄調控域[1-2]。DOF蛋白能夠特異地識別并結合真核生物基因啟動子區域的順式作用元件，如CCN4-like(GLM)、醇溶蛋白盒(prolamin box，PB)、5′-AACA/TA-3′基序等，從而激活或抑制基因轉錄[17]。DOF結構域外的氨基酸對識別能力沒有影響，但核心序列之外的側翼序列對DOF蛋白與DNA結合特性有一定的影響[18]。C-端轉錄調控域可接受不同信號途徑的調控，與不同類型調控蛋白相互作用激活或抑制基因的轉錄[1]。可見，DOF蛋白中氨基酸序列變異可導致其功能多樣性。已有研究表明，普通小麥wPBF與小麥醇溶蛋白、麥谷蛋白中的順式作用元件PB特異結合，參與這2類貯藏蛋白基因的表達調控[19-20]。本研究推導的烏拉爾圖小麥PBF蛋白與來源節節麥、普通小麥中國春PBF蛋白序列對比發現，所有PBF蛋白均具有DOF典型結構特征。然而，烏拉爾圖小麥PBF蛋白序列存在22個氨基酸變異位點：7個位于N-端DOF結構域之外和15個位于C-端調控區域，其中2個氨基酸變異(第22位點，A→S；第23位點，G→A)形成了烏拉爾圖小麥特有酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點。這些氨基酸變異位點可能對烏拉爾圖小麥PBF蛋白的調控功能產生影響，仍須進一步功能研究證實。綜上所述，本研究為進一步研究烏拉爾圖小麥PBF基因的相關特性、后續特異標記開發、功能分析等奠定基礎。