庫爾勒香梨離體葉片再生體系的建立

鐘 穎，馮建榮，樊新民 ，任歡喜，張秀抗，許竹葉

(石河子大學農學院/特色果蔬栽培生理與種質資源利用兵團重點實驗室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】庫爾勒香梨是新疆梨系統中最具代表性的優良品種，地域性極強，有1 400年栽培歷史，享譽國內外市場[1]。香梨風味甜美，肉質細膩，酸甜可口，已成為重要的出口創匯農產品之一[2]。經過長期栽培實踐，已育有一些優良品系，但香梨樹普遍存在坐果率低、產量不穩定、品質下降等問題。常規育種預見性差、周期長、效率較低[3],利用遺傳轉化技術改良香梨品質及產量相關特性，為分子水平改良培育香梨品種提供了很好的育種策略。但香梨轉基因育種進展緩慢，其主要原因是至今仍未建立有效的遺傳轉化體系，因此，庫爾勒香梨葉片再生體系的建立，是進行其遺傳轉化的前期基礎。【前人研究進展】梨離體葉片培養起步較晚，始于1988年。Laimer等[4]用西洋梨康弗倫斯(Conference)試管苗葉片做試驗，在6-BA和IBA的共同作用下，部分愈傷組織能夠形成球狀結構，但僅有少量的球狀結構轉化成了不定梢。Abu-Qaoud[5]、Chevreau[6]、Predieri[7]等相繼以幾種梨試管苗的葉片為材料并成功誘導出不定梢，但再生率不高。Lelay等[8]于1991年在改變氮源比例的條件下，康弗倫斯不定芽再生率高達 96.7%。目前已經有康弗倫斯、小香(Seckel)、考密斯(Comice)、帕西(Passe Crassane)等[9]歐洲梨品種取得了成功。在東方梨中，砂梨的冀蜜、豐水、二十世紀(Nijisseiki)、Kosui、Shinchu[10]和白梨的水晶梨[11]、謝花甜梨[12]及金花梨[13]等品種有了不定梢再生的報道。近幾年國內外對庫爾勒香梨組織培養研究較少，目前有關庫爾勒香梨組織培養主要集中在離體快繁技術方面。王建新等[14]以庫爾勒香梨的莖尖作為外植體，比較了三種基本培養基(MS 培養基、改良 MS 培養基、1/2MS 培養基)對增殖的影響，結果發現以改良MS培養基的增殖率最高，達到 66.7%。劉曉婷[15]以庫爾勒香梨葉片為外植體，是目前葉片誘導再生不定芽效率最高的，最佳的植物生長調節劑組合為1.0 mg/L TDZ 和0.5 mg/L NAA，葉片不定芽誘導率達到了77.78%。李致慧[16]指出庫爾勒香梨生根培養基(1/2 MS)中，暗培養5 d，NAA 濃度為 0.3 mg/L時生根率最高，可達 52.4%，且根粗壯長勢好，平均生根數是2.48。【本研究切入點】劉曉婷[15]沿用此生根配方，生根率達到 53%。研究建立庫爾勒香梨葉片誘導再生的穩定高效再生體系。【擬解決的關鍵問題】以庫爾勒香梨離體培養的繼代30 d左右的無菌苗葉片為材料，1/2 MS為基本培養基，用 TDZ與 IBA或 NAA分別組合設計配方，研究不同生長調節劑質量濃度組合對不定芽誘導過程中愈傷組織形成率和不定芽形成率的影響，為完善庫爾勒香梨再生體系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用品種為庫爾勒香梨，由新疆農科院輪臺國家果樹資源圃提供。3月底至4月初于資源圃采集一年生休眠枝條，將休眠枝條置于室內進行浸泡催芽，用于初代外植體的培養，參照實驗室的消毒方法獲得無菌苗[17]，以繼代30 d左右的無菌苗葉片作為材料。

1.2 方 法

1.2.1 葉片誘導愈傷組織再生不定芽

庫爾勒香梨葉片誘導不定芽選用 1/2 MS 培養基，1.0 mg/L的 TDZ 分別與 IBA (0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/L)、NAA(0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/L)進行組合。共計14個配方，每個配方接種30 個外植體，重復3次。據文獻[18]，使用 AgNO3有利于葉片再生不定芽，試驗選取最優生芽配方再附加不同質量濃度的AgNO3(0、0.5、1 mg/L)繼續優化，每個處理接種30個葉片，3次重復。

接種外植體均取離體培養的庫爾勒香梨無菌苗中上部完整幼嫩葉片，除去葉柄，垂直于葉片中脈橫切3～4刀，每片葉以遠軸面接觸培養基，先置于暗培養21 d后轉移到光培養，每天進行觀察記錄，第30 d繼代愈傷組織，在繼代前統計愈傷組織，30 d后進行不定芽繼代，繼代前統計不定芽形成率，愈傷組織約0.5 cm2記為有效愈傷組織，小于則忽略不計；形成的不定芽芽尖冒出大于0.5 cm記為有效不定芽，小于則忽略不計。

試驗光照強度均為 2 000 lx，溫度為(25±2)℃，每個培養基中均添加 30 g/L蔗糖，6.5 g/L瓊脂粉，pH 調至5.8。

1.2.2 誘導生根

選用1/2 MS培養基誘導香梨生根 ，為了保證用于誘導生根試驗的不定苗狀態相對一致，以繼代4周的無菌苗為試材，選取的再生苗平均株高約2 cm，莖粗約0.2 cm ，分別接種到附加到 IBA(0.5 mg/L)和NAA(0.3、0.6 、0.7、0.9 、1.1 、1.4 mg/L)的6 組生根配方，每個處理接種30株無菌苗，3 次重復。暗培養7 d，每天進行觀察記錄，培養35 d后統計生根率及生根數和生根長度,生根長度約大于1 cm記為生根，小于1 cm忽略不計。

培養條件同上。

1.3 數據處理

結果采用SPSS數據分析軟件處理數據，進行方差分析。

愈傷組織形成率% =形成愈傷組織葉片數/接種葉片數 ×100。

不定芽形成率%=再生芽總數/接種葉片數×100。

不定根再生率%=生根無菌苗數/接種無菌苗數×100。

平均生根數=總的生根條數/生根苗的數量。

平均生根長度=總的生根長度/總的生根條數。

2 結果與分析

2.1 1.0 mg/L TDZ與IBA或NAA組合對庫爾勒香梨誘導葉片愈傷組織的影響

接種后4～5 d 可以看到有愈傷組織開始出現，10 d時，葉片邊緣開始卷曲，葉片切傷處、葉柄端處開始長出少量淺黃色或淺白色愈傷組織(圖1A)，20 d時，各配方處理的葉片產生的愈傷組織膨大增多，顏色呈黃白色。在暗培養21 d后，轉至光培養，光培養5 d后愈傷組織開始由黃色向綠色轉變，少量的愈傷組織上有綠色的芽點(圖1B)。

研究表明，當TDZ濃度為1.0 mg/L時，愈傷組織誘導率隨IBA和NAA 濃度的增加呈先上升后下降的趨勢。IBA濃度為0.5、0.6、0.7和0.8 mg/L愈傷組織誘導率較高，分別為100%、100%、97.78%、97.78%，這些配方之間生長效果差異不顯著，但顯著高于其他處理。IBA為0.9 mg/L組織誘導率最低，為87.78%，顯著低于其他處理。 含NAA的配方組合的愈傷組織誘導率都很高，當NAA為0.4～0.8 mg/L愈傷組織誘導率均較高，為97.78%或100%，這些配方之間生長效果差異不顯著，但顯著高于其他處理。TDZ與含NAA的配方愈傷組織比TDZ與含IBA的配方愈傷組織的數量多、體積大、顏色更鮮綠。表1，圖1

表1 TDZ 1.0 mg/L與不同濃度IBA或NAA組合下庫爾勒香梨葉片再生變化
Table 1 Effects of TDZ 1.0 mg/L with different concentration of IBA or NAA on regeneration of Korla Fragrant Pear

處理Treatment 植物生長調節劑質量濃度Plant growth regulators(mg/L)IBANAA愈傷組織形態Callus shape愈傷組織形成率Frequency of callus formation (?SE) (%)不定芽形成率Frequency of shooting (?SE) (%)10.3淡黃色緊密體積小90±2.72de27.78±1.92g20.4淡黃色緊密體積小93.33±2.72cd41.11±1.92e30.5淡黃色緊密體積小100±0.00a74.44±1.92a40.6淡黃色緊密體積小100±0.00a71.10±5.09ab50.7淡黃色緊密體積小97.78±1.57ab71.11±1.92ab60.8淡黃色緊密體積小97.78±1.57ab66.67±5.09b70.9淡黃色緊密體積小87.78±1.57e61.11±1.92c80.3黃綠色緊密體積大95.55±1.57bc41.11±1.92e90.4黃綠色緊密體積大97.78±1.57ab47.78±1.92d100.5黃綠色緊密體積大97.78±1.57ab52.22±1.92d110.6黃綠色緊密體積大100±0.00a71.11±5.09ab120.7黃綠色緊密體積大100±0.00a36.66±3.33ef130.8黃綠色緊密體積大97.78±1.57ab32.22±1.92fg140.9黃綠色緊密體積大90±2.72de51.11±1.92d

注：表中數值后的字母表示鄧肯氏新復極差法在P=0.05時檢測的顯著水平，下同

Note：Different letters behind numerical value in this Table shows significance by Duncan’s atP=0.05. The same as below

2.2 1.0 mg/L TDZ與IBA或NAA組合對庫爾勒香梨愈傷組織誘導不定芽的影響

轉入光下培養5 d,出現有綠色芽點，形狀已明顯不同于愈傷組織，愈傷組織繼續分化，逐漸形成不定芽；30 d之后，不定芽大量形成，隨后不定芽速度減緩。研究表明，當TDZ 濃度為1.0 mg/L時，不定芽形成率隨IBA 和NAA 濃度的增加均呈先上升后下降的趨勢。當 TDZ 為1.0 mg/L時，IBA 濃度為0.3 mg/L愈傷組織也會產生少量的不定芽，但不定芽再分化芽很少(圖1F)，只有27.27%，顯著低于其他處理；當IBA 為 0.5 mg/L時不定芽形成率較高(74.44%)且生長狀況良好, 再生芽多為叢生芽(圖1C)，與 IBA 為 0.6、0.7 mg/L時不定芽形成率差異不顯著(圖1D、E)；IBA 為0.8 mg/L時不定芽形成率達66.67%，與最好的配方差異顯著。NAA為0.6 mg/L時，不定芽形成率較高且生長狀況良好(圖1G)，不定芽形成率達到最高，為71.11%，顯著高于含NAA配方的其他處理。

綜合不定芽形成率和再生芽的生長狀態，確定庫爾勒香梨葉片誘導再生不定芽的最優配方為1/2MS + TDZ 1.0 mg/L+ IBA 0.5 mg/L與1/2MS + TDZ 1.0 mg/L+ NAA 0.6 mg/L。表1，圖1

2.3 不同質量濃度的AgNO3對再生不定芽形成率的影響

研究表明，附加AgNO3對不定芽再生的效果不一，含IBA的配方附加0.5 mg/L AgNO3葉片再生不定芽率有明顯提高(圖1H)，為84.92%，顯著高于未添加AgNO3的再生芽率；附加1.0 mg/L AgNO3時，不定芽形成率顯著低于未添加AgNO3的再生芽率，對不定芽的形成有抑制作用。但對含NAA的配方附加0.5和1.0 mg/L AgNO3沒有促進不定芽的再生，其再生率反而低于未添加AgNO3的再生率(圖1I)。表2，圖1

A．10 d的再生愈傷組織;B.25 d的再生愈傷組織;C.接種在TDZ 1.0 mg/L +IBA 0.5 mg/L培養基上的不定芽;D. 接種在TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.6 mg/L培養基上的不定芽;E. 接種在TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.7 mg/L培養基上的不定芽;F. 接種在TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.3 mg/L培養基上的不定芽;G. 接種在TDZ 1.0 mg/L+ NAA 0.6 mg/L培養基上的不定芽;H. 接種在TDZ 1.0 mg/L +IBA 0.5 mg/L+ AgNO30.5 mg/L培養基上的不定芽;I. 接種在TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+ AgNO30.5 mg/L培養基上的不定芽;J.剛接種在生根培養基的無菌苗 K. 35 d 無菌苗在生根培養基的生長情況;L. 接種在IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.3 mg/L不定根再生;M. 接種在IBA 0.5 mg/L + NAA 0.6 mg/L不定根再生;N. 接種在IBA 0.5 mg/L + NAA 0.9 mg/L不定根再生;O. 接種在IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.7 mg/L不定根再生;P. 接種在IBA 0.5 mg/L+ NAA 1.1 mg/L不定根再生

A.10 days’ regeneration of the tissue ; B. 25 days’ regeneration of the tissue; C. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L medium; D. Adventitious bud inoculated in regeneration of the tissue in TDZ 1.0 mg/L +IBA 0.6 mg/L medium; E. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.7 mg/L medium ; F. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.3 mg/L medium ; G. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L medium ; H. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+ IBA 0.5 mg/L+ AgNO30.5 mg/L medium ; I. Adventitious bud inoculated in TDZ 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+ AgNO30.5 mg/L medium; J. A seedless vaccine that was first inoculated in a growing medium; K. The growth condition of the aseptic seedlings in the rooting medium for 35 days; L. Regeneration of adventitious roots inoculated in IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.3 mg/L medium; M. Regeneration of adventitious roots inoculated in IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.6 mg/L medium; N. Regeneration of adventitious roots inoculated in IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.9 mg/L medium O. Regeneration of adventitious roots inoculated in IBA 0.5 mg/L+ NAA 0.7 mg/L medium; P. Regeneration of adventitious roots inoculated in IBA 0.5 mg/L+ NAA 1.1 mg/L medium

圖1 A-P庫爾勒香梨葉片誘導再生愈傷組織、再生不定芽、生根情況
Fig.1 A-P are the regeneration of the tissue of the Korla pear, the regeneration of the bud and the root condition

表2 不同濃度 AgNO3和最優配方組合下庫爾勒香梨葉片再生不定芽變化

Table 2 The influence of different concentrations of AgNO3and the optimal formula on the regeneration of the leaf regeneration of the Korla pear

處理Treatment濃度 Concentration(mg/L)TDZIBANAAAgNO3不定芽形成率Frequency of adventitious bud formation(?SE) (%)110.5075.55±1.92b 210.50.584.92±1.92a 310.5165.55±1.92c410.6072.22±1.92b 510.60.541.11±1.92e610.6156.67±3.33d

2.4 0.5 mg/L IBA 和不同質量濃度的NAA 對庫爾勒香梨再生無菌苗生根的影響

研究表明，當 IBA 濃度為0.5 mg/L時，生根率、平均生根數量和平均根長度均隨著NAA 濃度的升高呈先升高后降低的趨勢。當NAA 濃度為 0.3 mg/L時，生根率顯著低于其他處理，為7.5%(圖1L)；隨著NAA 濃度增加，生根率也顯著提高(圖1O)，當NAA達到0.9 mg/L時，生根指標均達到峰值，再生苗的生根率為100%，顯著高于其他處理；平均生根數量5.66根，平均生根長度2.8 cm，且根系較其他處理更粗壯(圖1N)；當NAA濃度繼續增加時，平均生根數量及根長又顯著下降(圖1P)。圖1，表3

表3 0.5 mg/L IBA和不同NAA濃度下庫爾勒香梨無菌苗生根變化
Table 3 The effect of 0.5 mg/L IBA and different NAA concentration on rooting of Korla pear seedlings

處理Treatment植物生長調節劑質量濃度Plant growth regulators( mg/L)生根率Rotting rate(?SE)(%)平均生根數(株)No.of roots (?SE) 平均根長度(株)Length No.of roots(?SE) (cm)IBANAA10.50.37.5±0.02f3.1±1.24ab1.2±0.24b20.50.630±0.03e3.8±1.39ab1.34±0.38b30.50.788.9±0.02b5.06±1.98ab1.41±0.47b40.50.9100±0.00a5.66±1.46a2.8±0.66a50.51.166.7±0.03c2.53±1.82b2.45±0.96a 60.51.450±0.03d2.44±2.21b1.0±0.85b

3 討 論

劉曉婷[15]在庫爾勒香梨葉片誘導不定芽再生中分別比較NN69、MS、1/2MS和1/4 MS四種基本培養基，NN69 + 6-BA 2.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L+山梨醇20 g/L+瓊脂 7 g/L，葉片再生率可高達 66.55%，顯著優于其他基本培養基，提出NN69基本培養基是影響庫爾勒香梨葉片再生的最關鍵因子。在其他的梨品種上，如蘋果梨[19]和滿園香梨[20]也有研究提出NN69基本培養基對葉片生芽最好。試驗采用1/2 MS 基本培養基，附加1.0 mg/L TDZ + 0.5 mg/L IBA + 0.5 mg/L AgNO3，葉片誘導愈傷組織再分化形成不定芽，其不定芽形成率可以達到84.92%。表明1/2 MS基本培養基也適合誘導庫爾勒香梨葉片再生。

試驗中發現AgNO3濃度為 0.5 mg/L與TDZ和IBA組合，有利于庫爾勒香梨葉片愈傷組織誘導不定芽，秦璐等[21]在庫爾勒香梨葉片誘導不定芽再生中也有相似結果。另外試驗中在AgNO3與TDZ和NAA組合時，沒有促進庫爾勒香梨葉片愈傷組織誘導不定芽。但前人在金花和蒼溪兩個梨品種的葉片誘導不定芽中[22]，發現在培養基NN69+NAA0.2 mg/L+BA3 mg/L附加AgNO3在0～4 mg/L濃度范圍內都對金花不定芽再生有明顯的促進作用；蒼溪在附加AgNO30～8 mg/L濃度范圍時都表現出了對不定芽再生的促進作用。說明在金花和蒼溪兩個梨品種的葉片誘導不定芽中含NAA的配方附加AgNO3對葉片誘導再生不定芽有促進作用。與試驗研究結果有差異或許是外植體基因型不同造成。目前IBA、NAA對植物促進葉片不定芽再生的機制也未明確的研究結論，所以其與AgNO3如何互作在不定芽誘導中發揮作用還需要更進一步的研究。

4 結 論

當TDZ 濃度為1.0 mg/L時，愈傷組織形成率和不定芽率隨 IBA 的質量濃度升高先增加后下降，在0.5 mg/L IBA 時愈傷組織形成率和不定芽形成率均為最高值，愈傷組織形成率均為100%，不定芽形成率為74.44%；同樣TDZ 濃度時，愈傷組織形成率和不定芽率隨 NAA 的質量濃度也呈現先上升后下降的趨勢，在0.6 mg/L NAA時愈傷組織率達到100%，不定芽形成率達到71.11%。在兩個優選配方中添加0.5 mg/L AgNO3時，TDZ為1.0 mg/L，IBA 為0.6 mg/L時，不定芽形成率達到84.92%；而TDZ 和NAA組合的配方添加AgNO3不定芽形成率并沒有提高。在暗培養7 d，IBA 為0.5 mg/L時，生根率隨著 NAA 濃度的升高呈先升高后下降的趨勢，在濃度為0.9時達到峰值，為100%，平均生根條數為5.66，平均根長度為 2.8 cm。

庫爾勒香梨葉片誘導不定芽再生的最佳培養基為1/2 MS+TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L+AgNO30.5 mg/L，愈傷組織誘導率100%，不定芽形成率84.92%。最適宜香梨再生苗生根的培養配方是：1/2 MS + 0.5 mg/L IBA + 0.9 mg/L NAA，結合前期暗培養7 d，生根率可達100%。建立并優化了庫爾勒香梨的再生體系，為梨的遺傳轉化研究奠定基礎。