基于PCR-DGGE研究琚灣酸漿水中細菌多樣性及乳酸菌的分離鑒定

蔡宏宇，葛東穎，馬磊，張振東，葉萬海，余海忠，郭壯，趙慧君，*

（1.湖北文理學院食品科學技術學院鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北襄陽441053；2.棗陽食品藥品監(jiān)督管理局，湖北棗陽441200）

酸漿面為湖北省棗陽市的獨特面食，發(fā)源于清朝，距今已有100多年的歷史，2013年被列入湖北省第四批非物質文化遺產(chǎn)名錄。棗陽酸漿面的最佳食用時間為每年的4月至10月，在這段時間溫度適宜乳酸菌生長，采用白菜和芹菜制作的酸漿經(jīng)過一天的發(fā)酵，晚上食用酸度剛好。乳酸菌是（Lactic acid bacteria，LAB）一種習慣上的稱呼，是一種發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱[1]。乳酸菌分布廣泛，物種多樣性非常豐富，紅酒[2]、白酒[3]、發(fā)酵蔬菜[4-6]、乳品[7-8]等發(fā)酵食品中均蘊藏著豐富的乳酸菌資源。

聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術廣泛地運用到研究微生物生態(tài)，在發(fā)酵食品中也有非常廣泛地應用。意大利葡萄酒中植物乳桿菌和酒球菌的多樣性[9]、印度尼西亞單貝浸泡過程中微生物的群落結構和多態(tài)性[10]、丹魄酒蘋果酸發(fā)酵時期細菌的生物多樣性和動態(tài)變化[11]、不同來源的郫縣豆瓣醬中真菌多樣性[12]、漿水中細菌多樣性[4]等均采用了PCR-DGE的方法進行了分析。

為了發(fā)掘棗陽酸漿水中蘊含的乳酸菌資源，研究棗陽酸漿水乳酸菌的多樣性，從棗陽市琚灣鎮(zhèn)不同酸漿面館采集酸漿水，采用了PCR-DGGE方法對酸漿水中細菌的群落結構和多樣性進行了研究，同時利用純培養(yǎng)的方法分離純化酸漿水中的乳酸菌。通過本研究不僅可以了解棗陽酸漿水中細菌的群落結構和多樣性，也為后續(xù)開發(fā)菌種制劑和棗陽酸漿面的生產(chǎn)工業(yè)化、標準化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

聚丙烯酰胺、N，N-亞甲基二丙烯酰胺：國藥集團化學試劑有限公司；D5625-01 DNA提取試劑盒（OMEGA）、DNA marker（FERMENTAS）、PCR清潔試劑盒（AXYGEN）：北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；2×PCR mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；rTaq、dNTP，pMD18-T vector：大連寶生物技術有限公司（TaKaRa）；PCR引物合成和測序由武漢天一輝遠生物科技有限公司完成。

1.2 儀器與設備

CT15RE冷凍離心機：日本HITACHI公司；VeritiTM96-well thermal cyclerPCR 儀、NanoDrop 2000/2000c：美國Thermo Fisher公司；DCodeTMSystem：美國Bio Red公司；水平電泳儀：北京六一儀器廠；FluorChem FC3：美國protein simple公司；Bio-5000 plus掃描儀：上海中晶科技有限公司；Whitley DG250厭氧工作站：英國DWS公司。

1.3 試驗樣品

本試驗所用材料采集于湖北省棗陽市琚灣鎮(zhèn)酸漿面館。分別在10個獨立制作酸漿的酸漿面館采集未煮沸的酸漿水，采集后低溫保存，帶回實驗室進行后續(xù)試驗。

1.4 試驗方法

1.4.1 宏基因組DNA的提取與檢測

采用omega D5625-01試劑盒提取10個酸漿水樣品中的宏基因組DNA，提取后用0.8%瓊脂糖凝膠進行檢測并用NanoDrop測定DNA的濃度。

1.4.2 PCR擴增細菌和乳桿菌16S rDNA基因片段

將提取的宏基因組DNA濃度調整一致后作為模板進行PCR擴增。細菌16S rDNA基因片段PCR擴增所用的引物為：正向引物為ALL-GC-V3F（5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’），反向引物為 ALL-V3R（5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’）；乳桿菌16S rDNA基因片段PCR擴增所用的引物為：正向引物為LacF-GC（5’-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGC CCG GGG GCA CCG GGG GCT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3’），反向引物為 LacR（5’-GTA TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3’）[13]。PCR 擴增體系為2.5 μL 10×PCR Buffer（含Mg2+），2 μL dNTP（2.5 mol/L），0.5 μL 正向引物 （10 mmol/L），0.5 μL 負向引物（10 mmol/L），0.5 μL rTaq（5 U/μL），1 μL DNA 模板，18μL無菌水。PCR反應條件：95℃4 min預變性，95℃30 s，55 ℃（或 58 ℃）30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR擴增結束后，取擴增產(chǎn)物5 μL用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 DGGE及數(shù)據(jù)分析

細菌和乳桿菌DGGE均采用變性劑線性梯度為35%～60%，濃度為8%的聚丙烯酰胺濃度（40%丙烯酰胺/N，N-亞甲基二丙烯酰胺）凝膠進行電泳，PCR擴增產(chǎn)物上樣量為10μL。電泳時，溫度為60℃，先120V，78 min；后80 V，13 h。電泳結束對聚丙烯酰胺凝膠進行銀染[14]，用掃描儀采集凝膠電泳圖片，并用Quantity One軟件分析圖片。

1.4.4 DGGE膠上優(yōu)勢條帶的測序、比對及進化樹構建

將細菌DGGE膠上的優(yōu)勢條帶進行用不含GC夾子的引物進行擴增，擴增程序同上。與T-載體連接后轉化到大腸桿菌TOP10中，鑒定陽性克隆并送往武漢天一輝遠生物科技有限公司進行測序。將測序結果除去兩端載體的序列，然后利用NCBI Blast從GenBank數(shù)據(jù)庫中提取相似度比較高的相似的序列，用MEGA 4.0軟件制作系統(tǒng)發(fā)育樹，采Neighbor-joining（鄰位相連法）制作系統(tǒng)進化樹[15]，利用Bootstrap（自展法）檢測制作的系統(tǒng)樹[16]，自展數(shù)據(jù)集為1 000次。

1.4.5 棗陽酸漿水中乳酸菌的分離與純化

用滅菌槍頭吸取0.5 mL酸漿水樣品于4.5 mL的生理鹽水（質量分數(shù)0.85%）中，充分混勻，以10倍稀釋法對其進行梯度稀釋后，吸取100 μL稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液涂布與含有1.5%的CaCO3固體MRS培養(yǎng)基上并置于厭氧工作站37℃培養(yǎng)48 h。挑取有透明圈的菌落進行革蘭氏染色，染色結果為陽性的在MRS固體培養(yǎng)基上劃線純化兩次，鏡檢為單一菌落的保存在-80℃冰箱待用。

1.4.6 棗陽酸漿水中乳酸菌的鑒定

溴化十六烷三甲基銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取疑似乳酸菌DNA并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，采用通用引物27f（5’-A GA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’）和 1495r（5’-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3’）對乳酸菌16S rDNA基因進行PCR擴增。PCR擴增體系為2.5 μL 10×PCR Buffer（含 Mg2+），2 μL dNTP （2.5 mol/L），0.5 μL 27f（10 mmol/L），0.5μL 1495r（10 mmol/L），0.5 μL rTaq（5 U/μL），1 μL DNA 模板，18 μL 無菌水。PCR 反應條件：95℃ 4 min預變性，95℃1 min，55℃ 1 min，72℃1 min 30 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR擴增結束后，取擴增產(chǎn)物5 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。對于符合大小的擴增產(chǎn)物，對PCR產(chǎn)物進行清潔，并連接pMD-18T載體轉化到大腸桿菌TOP10中，鑒定陽性克隆并送往武漢天一輝遠生物科技有限公司測序。

1.4.7 棗陽酸漿水中乳酸菌的進化分析

棗陽酸漿水中乳酸菌的進化分析方法同1.4.4進化樹構建方法。

2 結果與分析

2.1 酸漿水中細菌和乳桿菌16S rRNA V3區(qū)域擴增產(chǎn)物DGGE圖譜分析

棗陽酸漿水中的DNA提取成功后，進行細菌和乳桿菌16S rRNA V3區(qū)域擴增，擴增片段大小200 bp左右，且無非特異性擴增，可以用于DGGE分析。10個棗陽酸漿水樣品的細菌和乳桿菌DGGE結果如圖1所示。

圖1 棗陽酸漿水細菌DGGE圖譜和乳桿菌DGGE圖譜Fig.1 DGGE analysis of bacteria and lactobacillus in Zaoyang suanjiangshui

DGGE圖譜中條帶的數(shù)量反映樣品中微生物的多樣性，條帶的亮度在一定程度上能反映菌種數(shù)量的多少。從圖1中可以看出，細菌（A）與乳桿菌（B）DGGE圖譜的差異就在于細菌DGGE圖譜的最下面有標號6、7兩個條帶，其余部分基本相同，且兩個DGGE膠變性劑梯度相同，因此推斷細菌DGGE除6、7條帶外其余條帶與乳桿菌DGGE基本相同。

2.2 棗陽酸漿水中細菌DGGE圖譜聚類分析

棗陽酸漿水中的細菌聚類分析見圖2。

圖2 棗陽酸漿水中的細菌聚類分析Fig.2 The cluster analysis of bacteria in Zaoyang suanjiangshui

由圖2可知，初步將10個酸漿水樣品分為了三類，第一類（5#），第二類（1#，2#，8#），第三類（3#，4#，6#，7#，9#，10#），這與圖1的直觀反映是一致的。反映在DGGE圖譜中就是在這些酸漿水中既存在一些共有的細菌，又存在一些特有的細菌種群。由于棗陽酸漿的制作是以家庭為單位進行的，所以酸漿水中的細菌種類不但與制作酸漿的材料有關，也與酸漿水續(xù)用次數(shù)和家庭環(huán)境相關，造成了DGGE圖譜上細菌種群豐度存在著一定的差異。

2.3 棗陽酸漿水中細菌DGGE條帶測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

對棗陽酸漿水樣品DGGE圖譜上的代表性亮帶進行切膠、擴增、克隆和測序，與NCBI上的模式菌株進行比對（表1）并構建進化樹（圖3）。

表1 棗陽酸漿水中細菌DGGE條帶比對結果Table 1 Blast results of DGGE in Zaoyang suanjiangshui

圖3 棗陽酸漿水中細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of bacteria in Zaoyang suanjiangshui

由圖3可知，測序結果分為了3個類別，類別I聚集了大多數(shù)序列，主要為Lactobacillus amylolyticus和Lactobacillus delbrueckii，包含條帶 1、2、4、5、7、8 和12。類別II為Lactobacillus fermentum和Lactobacillus panis，包含條帶 3、6、9、10 和 11。類別 III為 Lactobacillus acidipiscis，只有條帶13。從系統(tǒng)發(fā)育來看，乳桿菌占據(jù)了大部分比例，且具有一定的多樣性。

2.4 棗陽酸漿水中分離乳酸菌的比對結果

利用含有1.5%CaCO3的MRS培養(yǎng)基分離棗陽酸漿水中的乳酸菌，挑選有透明圈、革蘭氏染色為陽性的菌株進行分子生物學鑒定，最終從棗陽酸漿水中分離出15株乳酸菌，均為乳桿菌。測序結果在NCBI上進行比對（結果見表2），其中10株為Lactobacillus fermentum，3株為 Lactobacillus plantarum，一株為 Lactobacillus agilis，一株為 Lactobacillus delbrueckii。這與PCR-DGGE的結果是相同的，Lactobacillus fermentum在酸漿水中為優(yōu)勢菌屬。

表2 棗陽酸漿水中16S rDNA基因序列的分析結果Table 2 Results from 16S rDNA sequences analysis of Zaoyang suanjiangshui

對棗陽漿水中的乳酸菌進行系統(tǒng)進化分析，結果見圖4。

圖4 基于16SrDNA基因序列構建棗陽酸漿水中乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA region gene sequences of lactobacillus in Zaoyang suanjiangshui

從圖中看以看出，編號為 1、3、4、6、7、8、10、13、14和15的歸為一類，均為Lactobacillus fermentum；編號為5和9為歸為Lactobacillus plantarum；編號為2的歸為Lactobacillus agilis；編號為11的歸為Lactobacillus delbrueckii。

3 結論

以細菌16S rDNA基因序列為靶點基于PCRDGGE技術對棗陽酸漿水中細菌多樣性進行了分析，發(fā)現(xiàn)在酸漿水中絕大多數(shù)細菌為乳酸菌，但是不同地點采集的酸漿水細菌的多樣性并不一致。對DGGE中的典型條帶進行測序分析，13個典型條帶的測序結果歸為5個菌屬，分別為Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillusdelbrueckii、Lactobacillusfermentum、Lactobacillus panis和 Lactobacillus acidipiscis，其中 Lactobacillus fermentum在所有樣品中均存在且為最具優(yōu)勢的乳酸菌。利用純培養(yǎng)的方法從棗陽酸漿水中分離出15株乳酸菌，測序后發(fā)現(xiàn)均為乳桿菌，其中10株為Lactobacillus fermentum，這與PCR-DGGE的結果是一致的。因此推斷，棗陽酸漿水中乳酸菌為主要的細菌，其中乳酸菌的優(yōu)勢菌株為Lactobacillus fermentum。