四川不同產地厚樸HPLC指紋圖譜及含量測定研究

任波，董佳悅，安太勇，劉美琳，張梅

（成都中醫藥大學中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137）

厚樸來源于木蘭科植物厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）或凹葉厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.）的干燥干皮、根皮及枝皮。收載于2015年版《中國藥典》一部，具有燥濕消痰、下氣除滿的功效[1]，臨床上主要應用于治療抑郁癥、腸梗阻、慢性肝炎、緩解更年期癥狀等病癥[2-4]。現代化學研究表明厚樸中主要化學成分包括木脂素、揮發油及生物堿類等。藥理研究表明厚樸具有抑菌、抗腫瘤、促進胃腸蠕動等作用[5-6]。四川作為厚樸的道地產區與主要產區之一，川內厚樸種質資源遍布了都江堰市、樂山市（沐川、馬邊等）、阿壩州（松潘、汶川、茂縣等）、雅安、峨眉山市等多個產地。據報道不同品種、不同產地間的厚樸化學成分組成及含量差異顯著[7-8]。而且同一厚樸中不同類型化學成分相差較大，其中厚樸酚、和厚樸酚成分居首要地位，遠遠高于紫丁香苷、木蘭花堿等成分，運用單波長檢測方法不能全面體現厚樸藥材的整體信息。因此本文采用多波長切換技術方法[9-11]，對四川42個不同產地厚樸（二十年樹齡左右）建立高效液相色譜法（high efficiency liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜，同時測定藥材中厚樸酚、和厚樸酚的含量，以期尋找四川不同產地間厚樸化學成分及含量的異同，為全面控制和評價四川木蘭科植物厚樸的質量提供合理依據。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（包括Agilent 1200四元泵、Agilent 1200色譜工作站、DAD檢測器）：美國Agilent公司；BSA224S型電子分析天平、BP211D型電子天平：北京賽多利斯科學儀器有限公司；2004A版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統：國家藥典委員會；KQ－500DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 樣品及試劑

厚樸酚（Magnolol，MUST－14072405）、和厚樸酚（Honokiol，MUST－14092818）、木蘭花堿（magnoflorine，MUST-14122416）、紫丁香苷（syringin，MUST-15021504）對照品，純度均≥98%：成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈為色譜純：美國Fisher公司；其他試劑均為分析純：成都市科龍化工試劑廠；純凈水（Milli－Q純水制備系統制備，0.45 μm濾膜濾過）。

1.3 藥材

42份厚樸樣品分別從四川都江堰、峨眉山、樂山、雅安及眉山等地收集，經成都中醫藥大學中藥資源與鑒定系裴瑾教授鑒定，所有樣品均為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils的干燥干皮、根皮及枝皮。厚樸藥材來源見表1。

表1 厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）藥材來源Table 1 Magnolia（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）officinalis source

續表1 厚樸（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）藥材來源Continue table 1 Magnolia（Magnolia officinalis Rehd.et Wils）officinalis source

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫 0～5 min，5%A；5 min～20 min，5%～20%A；20 min～30 min，20%～70%A；30 min～50 min，70%～90%A；50 min～60 min，90%～5%A；體積流量 0.8 mL/min；柱溫 35 ℃，進樣量 20 μL，檢測波長：265 nm（0～31 min，木蘭花堿、紫丁香苷）、294 nm（31 min～60 min，厚樸酚、和厚樸酚）。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取對照品厚樸酚、和厚樸酚，紫丁香苷、木蘭花堿適量，加70%的甲醇配制成厚樸酚1.560 g/L、和厚樸酚2.000 g/L、紫丁香苷1.530 g/L、木蘭花堿1.295 g/L對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液2.5、0.5、0.5、1 mL 置于 5 mL 容量瓶中，加 70%甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取厚樸粉末（過三號篩）1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇40 mL，稱重，密封，超聲輔助提取40 min，放冷，稱重，加70%甲醇補足減失的重量，搖勻，即得。

2.4 四川不同產地厚樸高效液相色譜法指紋圖譜的建立

2.4.1 精密度試驗

取供試品粉末（S36），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，連續進樣6次。結果表明，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.05%～1.13%，0.43%～2.95%，均小于3%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜測定相關要求。

2.4.2 重復性試驗

取同一批供試品粉末（S36），平行6份。按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件依次進樣檢測，測定HPLC圖譜。計算其各共有峰的相對保留時間、相對峰面的RSD分別為0.03%～1.21%，1.90%～2.69%，均小于3%，表明重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液（S36），按“2.1”項下色譜條件在0、2、4、8、16、24h 分別進樣行 HPLC 分析。結果表明，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD分別為0.05%～2.35%，1.25%～2.58%，均小于3%，表明24 h內其穩定性良好。

2.4.4 四川不同產地厚樸HPLC指紋圖譜的建立

精密稱取42批厚樸粉末，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件依次進樣檢測，記錄色譜圖，以峰面積大于總峰面積的2%為限度，選取色譜峰作為指紋特征峰。共選取9個共有峰，通過與對照品比對，在265 nm下，指認了2個共有峰，分別為紫丁香苷（1號峰）、木蘭花堿（5號峰）；294 nm時，標記了2個共有峰，分別為和厚樸酚（8號峰）、厚樸酚（9號峰）。其結果見圖1、圖2、圖3。

2.4.5 相似度評價

采用藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A）軟件，將42批四川不同產地厚樸藥材HPLC指紋圖譜數據導入分析，見表2。

得到其指紋圖譜與對照指紋圖譜之間相似度為0.868～0.990，其中都江堰龍池鎮虹口景區觀風溝和峨眉山市符溪鎮豐收村相似度較低，分別為0.884和0.868；其余產地厚樸樣品的相似度均在0.9以上，說明四川不同產地間厚樸藥材差異較小。

圖1 混合對照品HPLC指紋圖譜Fig.1 Chromatograms of mixed reference solution

圖2 供試品溶液HPLC指紋圖譜Fig.2 Sample solution of Magnolia officinalis

圖3 42批樣品溶液HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC matched chromatograms for 42 batches of Magnolia officinalis

表2 42批四川不同產地厚樸多波長切換對照指紋圖相似度Table 2 Similarity results table of reference fingerprint at different batches of Magnolia officinalis

續表2 42批四川不同產地厚樸多波長切換對照指紋圖相似度Continue table 2 Similarity results table of reference fingerprint at different batches of Magnolia officinalis

2.4.6 指紋圖譜聚類分析

選取42個四川不同產地厚樸多波長切換指紋圖譜4個共有峰相對峰面積為變量，得到42×4階原始數據矩陣，運用SPSS 19.0軟件，采用中位數聚類法，以夾角余弦為樣品相似度的距離公式對藥材進行系統聚類分析，聚類分析結果見圖3。

由圖3可知，四川不同產地厚樸藥材被分為三大類，第一類包括：S1；第二類包括：S5；第三類包括：S2、S3、S4、S5、S6、S7、7S8、S9、S10、S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S21、S22、S23、S24、S25、S26、S27、S28、S29、S30、S31、S32、S33、S34、S35、S36、S37、S38、S39、S40、S41、S42。通過聚類分析發現，四川各產地厚樸藥材之間的相關性與相似度分析結果較為一致。

圖3 42批厚樸樣品聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of cluster analysis for 42 batches of Magnolia officinalis

2.5 厚樸中厚樸酚、和厚樸酚的含量測定

2.5.1 精密度考察

精密吸取同一供試品溶液（S36），按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，連續進樣6次。厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.58%，1.41%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性考察

取同一批供試品粉末（S36），平行6份。按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件依次進樣檢測，測定HPLC圖譜。厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.86%、0.03%，均小于3%，表明重復性良好。

2.5.3 穩定性考察

精密吸取同一供試品溶液（S36），按“2.1”項下色譜條件在 0、2、4、8、16、24 h 分別進樣行 HPLC 分析。厚樸酚、和厚樸酚峰面積的RSD分別為1.96%、2.34%，均小于3%，表明24 h內穩定性良好。

2.5.4 線性關系考察

分別將2.2項下的厚樸酚、和厚樸酚的對照品溶液，用70%的甲醇逐級稀釋，得到厚樸酚質量濃度分別為 1.560、1.365、1.170、0.585、0.390、0.195 g/L；和厚樸酚質量濃度分別為 1.000、0.800、0.400、0.100、0.050、0.025 g/L的系列混合對照品溶液；分別吸取20 μL注入液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件依次進樣檢測。以質量濃度（X，g/L）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，得回歸方程。厚樸酚的回歸方程為Y=35.742X-715.94（r=0.999 9），在0.195 g/L～1.560 g/L范圍內其濃度與峰面積呈良好的線性關系；和厚樸酚的回歸方程為Y=41.821X+70.081（r=0.999 3），在0.025 g/L～1.000 g/L范圍內其濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.5.5 加樣回收率試驗

稱取厚樸樣品（S36）6份，每份0.1 g，精密稱定。分別精密加入與樣品中厚樸酚、和厚樸酚含量相當的厚樸酚3.12 mg、和厚樸酚0.8 mg對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算平均回收率。結果厚樸酚、和厚樸酚的平均回收率分別為97.17%，96.41%；RSD分別為2.98%、2.56%。表明該方法準確度良好。

2.5.6 樣品的測定

取42批四川不同產地厚樸粉末1 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結果見表3。

2.5.7 樣品測定結果分析

采用HPLC波長切換方法對42個四川不同產地的厚樸進行了定量測定，見表4。

表3 不同產地厚樸中厚樸酚、和厚樸酚含量測定結果Table 3 Determination of magnolol and honokiol in Magnolia officinalis from different habitats

續表3 不同產地厚樸中厚樸酚、和厚樸酚含量測定結果Continue table 3 Determination of magnolol and honokiol in Magnolia officinalis from different habitats

表4 厚樸酚、和厚樸酚含量藥典方法測定結果Table 4 Determination of magnolol and honokiol in Magnolia officinalis by the pharmacopoeia method

厚樸酚含量為8.56 mg/g～36.41 mg/g，和厚樸酚含量為5.29 mg/g～29.17 mg/g。厚樸酚、和厚樸酚總含量范圍分別為14.36 mg/g～65.58 mg/g，其中除峨眉山市豐收村、茶地村、樂山市劉溝村、麻柳鄉及阿壩州的厚樸中厚樸酚、和厚樸酚總含量較低外，其他產地中厚樸酚、和厚樸酚總含量均大于2.0%，符合藥典要求。同時參照《中國藥典》（2015年版）厚樸含量測定方法對S1樣品進行測定，結果藥典方法所測樣品中厚樸酚、和厚樸酚總含量與試驗中建立的HPLC方法測定厚樸酚、和厚樸酚結果基本一致（表4）。說明該方法準確、有效，適用于川產厚樸中厚樸酚、和厚樸酚定量測定。

3 結論與討論

3.1 提取條件考察

試驗中分別考察甲醇、乙醇兩種提取溶劑，結果甲醇為提取溶劑時，峰數較多，峰形較好；對60%、70%、100%的甲醇進行考察，結果以70%甲醇為提取溶劑時，各主要色譜峰峰面積較大，信息較豐富，故選用70%的甲醇為提取溶劑。對超聲、回流兩種提取方式進行考察，得到的供試液的HPLC色譜無明顯差異，由于超聲操作較方便，故選擇超聲提取。對提取時間進行考察，結果表明40 min后各時間提取率基本一致，故選擇超聲時間為40 min。

3.2 洗脫條件的考察

試驗中對甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水等4個系統的流動相考察，最終確定在乙腈-0.1%磷酸水作為流動相條件下，分離度較好，且基線穩定，有利于指紋圖譜分析，因此采用乙腈-0.1%磷酸水作為流動相系統。

3.3 檢測波長的考察

試驗通過使用DAD檢測器在波長190 nm～400 nm紫外區進行全波長掃描，測定其最大吸收波長分別為紫丁香苷265 nm、木蘭花堿265 nm，厚樸酚294 nm，和厚樸酚294 nm。基于各成分最大吸收波長不同，且厚樸中厚樸酚、和厚樸酚含量遠遠高于其他成分，為確保厚樸藥材指紋圖譜的全面性，減少含量差異顯著帶來的干擾，本試驗采取HPLC波長切換技術測定厚樸藥材的HPLC指紋圖譜及厚樸酚、和厚樸酚的含量測定。

本試驗建立的指紋圖譜較文獻有一定的進步。本試驗中首次應用多波長切換技術對42批四川不同產地厚樸樣品進行HPLC指紋圖譜的測定，在四川厚樸藥材中共標定9個共有峰，通過對照品比對，對其中紫丁香苷、木蘭花堿、厚樸酚、和厚樸酚4個共有峰進行了指認，完善了厚樸指紋圖譜的信息。結合相似度計算和聚類分析對指紋圖譜進行綜合評價，發現四川各產地厚樸藥材之間的相關性與相似度分析結果較為一致，42批厚樸樣品HPLC色譜圖相似度為0.868～0.990，說明各產地厚樸中成分組成差異較小。

本試驗對不同產地厚樸中厚樸酚、和厚樸酚的總含量分析可知，其范圍在14.36 mg/g～65.58 mg/g，各個產地含量差異顯著。厚樸酚、和厚樸酚作為厚樸中主要活性成分之一，據相關研究發現不同質量濃度的厚樸酚、和厚樸酚對鼻咽癌細胞系HONE1進行處理，濃度越大，對HONE1抑制效果更明顯；在雙向調節胃腸運動，肝臟保護等多方面的作用，發現厚樸酚（0.3 μmol/L～30 μmol/L） 可劑量依賴性增加回腸縱行肌收縮的頻率和振幅。此外和厚樸酚對致齲菌產酸均有一定的抑制作用，且隨著藥物濃度增加，抑制作用增強[12-14]。證明了厚樸酚、和厚樸酚的含量對調整胃腸運動、抗菌、抗炎、抗腫瘤方面呈一定的量-效關系。因此提示我們在評價厚樸藥材質量時，不僅要符合藥典規定，還需關注厚樸酚、和厚樸酚含量對其藥效作用的影響，從而建立厚樸中厚樸酚、和厚樸酚總含量的有效范圍，為全面評價四川厚樸藥材的質量提供合理的參考。