新疆藥桑葉多糖的提取工藝與純化分離研究

崔漢釗，郝蒙蒙，楊玲

（1.塔里木大學生命科學學院，新疆阿拉爾843300；2.新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆阿拉爾843300）

桑葉是一種傳統的中草藥，在我國具有豐富的資源。藥桑（Morus nigra L.）屬半栽培半野生資源，在植物分類學上屬桑科桑屬黑桑種，原產于伊朗，16世紀在我國新疆等地開始栽培，是我國唯一的黑桑品種，唯一具有22倍花性染色體的桑樹品種，分布于新疆和田、庫車等地區[1]。藥桑葉及果實一直被維吾爾族作為民間藥材，用以治療急慢性扁桃體炎、風濕關節痛、咽喉腫痛等疾病[2]。桑葉中含有豐富的黃酮、生物堿、多糖、蛋白質等物質[3-5]。其中多糖是桑葉中的主要活性成分之一，研究報道證實桑葉多糖具有明顯的抗腫瘤、降血糖、抗氧化等功效[6-11]。

目前對藥桑葉中生物活性成分的研究主要集中在黃酮、生物堿、多糖等方面，對植物中的多糖分離多采用纖維素層柱[12-13]，但此填料活化后重現性差，對多糖的損失率大。本研究通過水提法探討藥桑葉多糖適宜的提取工藝條件，在此基礎上用對其進行醇沉、脫蛋白、脫色；離子交換柱層分離，發現此分離柱重現性好，多糖的損失率低。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑葉采自新疆庫車，經塔里木大學邱愛軍副教授鑒定為藥桑葉；無水乙醇、濃硫酸、苯酚、氯仿、正丁醇均為分析純；DEAE-Sepharose Fast Flow：Phamacia公司；AB-8大孔樹脂：安徽三星樹脂科技有限公司；D-無水葡萄糖標準品（批號：S08J6）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

759S紫外可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；N-1100型旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司；透析袋（截流量為3 500 Da）：美國Spectrum公司；高速粉碎機：濰坊市北方制藥設備制造有限公司；DZKW-S-6電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藥桑葉粗多糖的提取純化流程

藥桑葉→粉碎過篩→乙醇脫色、脫脂→熱水浸提→離心、抽濾→濾液→醇沉→脫蛋白、脫色→透析→冷凍干燥→藥桑葉粗多糖

1.3.2 藥桑葉多糖的含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定其中多糖的含量[14]，以D-無水葡萄糖作為對照。取D-無水葡萄糖，加水溶解使濃度為0.1 mg/mL作對照品溶液。分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的葡萄糖于試管中，用水補至2 mL，分別加入1 mL、6%的苯酚和5 mL濃硫酸混勻后冷卻至室溫。以相應的試劑為空白，489 nm處測定其吸光度。葡萄糖的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制葡萄糖的標準曲線。得到回歸方程：Y=13.163X+0.008 1，R2=0.996（Y為吸光度，X為葡萄糖濃度）。在0.02 mg/mL～0.06 mg/L范圍內具有良好的線性關系。藥桑葉多糖含量測定：吸取2 mL多糖水溶液測定其吸光度，根據回歸方程計算其濃度。多糖的提取率計算公式：多糖含量/%=（多糖質量/藥桑葉粉末質量）×100。

1.4 提取工藝試驗及優化

單因素試驗設計：分別考察不同的液料比、提取時間、提取溫度對多糖提取率的影響。在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗優化藥桑葉多糖的提取工藝。確定料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）為考察因素，每個因素確定3個水平，做L9（34）正交試驗優化藥桑葉多糖提取工藝參數。每組平行試驗3次。

1.5 藥桑葉多糖粗品的純化

按照前面得到的最佳提取工藝，得到藥桑葉多糖水溶液，水溶液離心后取上清液。上清液減壓濃縮到原體積的1/4，加入無水乙醇，使其中乙醇的最終濃度為80%。4℃冰箱中過夜，5 000 r/min離心5 min得藥桑葉多糖沉淀，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌3次。

沉淀用水溶解，多糖水溶液中加入等體積的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比），強烈振搖10 min，靜置分層，除去交界處變性蛋白層和有機溶劑層，重復處理多次，至雙縮脲試劑鑒定無紫色出現。

脫蛋白后的藥桑葉多糖水溶液與AB-8大孔樹脂混合進行脫色，比例為1∶25（質量比）在室溫下以每分鐘300轉的速度振動12 h。混合液裝入層析柱中（60 mm×700 mm），以蒸餾水洗脫，收集洗脫液，苯酚-硫酸法檢測直至無多糖洗出。

脫蛋白、脫色后的多糖水溶液裝入透析袋（截流量為3 500 Da）中，蒸餾水透析24 h，除去小分子物質。透析完成后冷凍干燥得到藥桑葉多糖粗品。

1.6 藥桑葉多糖粗品的分離

取純化后的200 mg藥桑葉多糖粗品溶于20 mL去離子水中，離心取上清液，用滴管加入平衡好的DEAE-SepharoseFast Flow柱層析中（25 mm×400 mm）。依次用 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaCl進行洗脫，洗脫液吸光度為0時更換洗脫液。流速為1 mL/min。每管收集5 mL。隔管用苯酚-硫酸法在489 nm處測定其吸光度，以管數為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制繪制洗脫曲線圖。根據洗脫曲線圖，將各洗脫峰樣品收集合并，經濃縮、透析除鹽后冷凍干燥。

2 結果與分析

2.1 液料比對藥桑葉多糖含量的影響

在提取溫度90℃，提取時間4 h的條件下。選取料液比范圍為 1 ∶10（g/m L）～1 ∶60（g/m L），探討其對多糖得率的影響。結果見圖1。

圖1 料液比對多糖含量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio of polysaccharide content

從圖1可以看出，多糖含量隨著料液比的增加而增加，1∶30（g/mL）后趨于穩定。在考慮后續減壓濃縮時，提高工作效率，選取料液比 1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）為優化范圍。

2.2 提取時間對藥桑葉多糖含量的影響

在提取溫度90℃，料液比1∶40（g/m L）的條件下，選取時間范圍為2 h～5 h，考察提取時間對多糖得率的影響。結果如圖2所示。

圖2 提取時間對多糖含量的影響Fig.2 Effects of time on the rate of polysaccharide extract

從圖2可以看出，隨著時間的增加藥桑葉多糖得率先增加后減小。可能隨著時間的推移，環境中的微生物把多糖分解，降低了多糖的含量[15]。因此選用2、3、4 h為優化范圍。

2.3 提取溫度對藥桑葉多糖含量的影響

在料液比為 1∶40（g/m L），提取時間 4 h 的條件下，選取溫度范圍為50℃～100℃，考察提取溫度對多糖得率效果的影響，結果如圖3所示。

從圖3可以看出，多糖的含量隨著溫度的升高而提高，得率增加明顯。在溫度90℃和100℃時達到最高。但在100℃時增加不大，考慮到溫度過高可能影響物質的活性，因此選取70、80、90℃為優化范圍。

圖3 提取溫度對多糖含量的影響Fig.3 Effects of temperature on the rate of polysaccharide content

2.4 正交試驗優化結果

正交試驗因素水平表見表1，正交試驗結果及分析見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors level table of orthogonal test

表2 正交試驗結果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test

由正交試驗結果得最優提取條件為A2、B2、C3，即，料液比1∶30（g/mL），時間3 h，溫度90℃。根據方差分析，在所選試驗范圍，各因素對多糖含量的影響主次為A（溫度）＞B（料液比）＞C（時間）。提取溫度對藥桑葉多糖含量的影響較顯著。在此優化工藝條件下，重復試驗3次，測得結果分別為8.95%、8.98%、9.00%。平均得率為8.98%。RSD=0.28%。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

2.5 多糖分離純化結果

在80%濃度乙醇溶液下，多糖水溶液中出現大量棕色絮狀物沉淀。脫蛋白、樹脂脫色和透析后得到淺灰色的粉末。NaCl溶液的梯度洗脫之后，得到水相和0.1 mol/L NaCl中兩個單一峰，并且峰面積比較大（圖4）。其它梯度幾乎沒有洗脫峰。收集水洗脫的組分和0.1 mol/L NaCl溶液的洗脫組分，減壓濃縮冷凍干燥。分別命名為組分Ⅰ、組分Ⅱ。測其含量分步為：5.9 mg、2.7 mg。由此可初步判斷藥桑葉至少含有兩種多糖成分，其中以水洗脫峰面積最大，推測此組分為藥桑葉中含量最高的多糖部分。

圖4 DEAE-SepharoseFast Flow離子交換柱洗脫曲線Fig.4 Elution cure of polysaccharide on DEAE-SepharoseFast Flow ion exchange colum

3 結論

應用正交試驗設計方法優化藥桑葉中多糖提取工藝，得到藥桑葉多糖的最佳提取工藝為料液比1∶30（g/mL），提取時間3 h，溫度90℃，得率為8.98%。用DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱分離經脫蛋白質、脫色、透析過的藥桑葉粗多糖得到2個多糖組份，為多糖組分的結構及活性研究奠定了基礎。