木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl-K2HPO4雙水相體系中相平衡數據的關聯及分配模型的建立

朱新儒，余壘，張海德

（海南大學食品學院，海南海口570228）

傳統的提取技術有鹽析法、有機溶劑法、親和層析法以及超濾法等[1]。然而這些技術存在諸如工藝過程繁瑣、溶劑的組成成分有毒、提取率較低以及成本較高等局限性[2]。雙水相（aqueous two-phase system，ATPS）萃取技術，亦稱水溶液兩相分配技術，是現階段的一種分離新技術[3]。雙水相體系的優點明顯，如生物相容性高、操作時間短、設備簡單、操作條件溫和、易于連續化操作和工藝放大等[4]，因此被廣泛運用。

近年來，國內外的學者們已經對雙水相體系進行了全面的研究，包括新型雙水相體系的開發、雙水相體系中物理性質和熱力學性質的測定，體系分配模型的建立、傳質性能的研究、生物活性物質的分配行為、萃取工藝參數的優化、以及離子液體聚合物的回收[5-7]等，這些研究都已取得很大進展。國外關于雙水相模型的研究較成熟些。Diamond等[8]提出了Diamond-Hsu模型，該模型在一定程度上對聚合物雙水相體系的試驗數據進行了很好的擬合。國內目前關于雙水相模型的研究還不夠完善，國內主要的模型是：滲維里模型、Flory-Huggins晶格模型、胞腔理論和局部組成模型。這4種理論相互獨立，又互相影響，分別從滲透壓、能量、分子間作用力及溶液組成幾個方面進行了闡述[9]。此外，國內外的學者們對于雙水相的研究現多集中在基于吡啶的離子液體上，因為相關研究已經表明，吡啶類物質的生物降解途徑通常比其基于咪唑等的對應物更環保[10]。

現階段，關于各類雙水相體系相行為的研究層出不窮。Dragana P.C.de Barros等[11]在聚合物/聚合物ATPS中探討具有不同性質的14種球狀蛋白的分配行為。通過Colander方程，觀察到所有系統中的蛋白分配系數之間的線性相關性。結果表明使用半經驗模型，可以預測蛋白質的分配行為。Luisa A[12]對聚乙二醇/葡聚糖體系的分配系數與聚乙二醇的質量分數進行關聯，結果表明對于雙聚合物體系的分配系數的預測效果較好。

目前相關的研究報道酶在離子液體/鹽雙水相體系的分配系數K的大小主要是由鹽析作用、表面電荷、疏水相互作用等因素共同決定的[13]，而對酶在氯代吡啶類離子液體雙水相中分配行為的預測及模型建立的研究則較少。為探討木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶類離子液體雙水相體系中的分配規律，試驗測定了[CnPy]Cl-K2HPO4雙水相體系的雙節線及液液相平衡數據并進行關聯。進一步對木瓜蛋白酶在該體系中的蛋白濃度分配系數與上下相各成分濃度的相關度進行研究，以此建立木瓜蛋白酶在該類離子液體雙水相體系中的分配模型，研究結果也可為木瓜蛋白酶在該體系中的工程放大設計計算提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

N-正乙基吡啶氯鹽（EPyCl）、N-正丁基吡啶氯鹽（BPyCl）、N-正己基吡啶氯鹽（HPyCl）均為海南大學李運強理工實驗大樓C513試驗室合成的離子液體試劑（純度＞90%）；木瓜蛋白酶（＞2 000 U/mg）：上海生工股份有限公司；K2HPO4（AR）、氫氧化鈉（AR）、鹽酸（AR）：阿拉丁化學試劑公司；其他所有試劑均為市售分析純試劑。

1.2 儀器與設備

FA2104分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；PHS-2F PH計：上海雷磁儀器廠；2WAJ阿貝折射儀：上海光學儀器一廠；TU1810紫外可見分光光度計：北京普析通用有限責任公司；DK-98-1恒溫水浴鍋：天津泰斯特儀器有限公司；DF-2A集熱式磁力攪拌器：常州華奧儀器制造有限公司；WH-866旋渦混合器：太倉市華利達試驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 相圖的測定

參照高向陽等[14]方法，測定相圖：在25℃的體系環境下，采用清-濁點輔助相圖制作法測定氯代吡啶類離子液體雙水相體系的雙節線。進一步選取適當的點配制相應濃度的溶液體系，繪制三角相圖。分別量取質量分數為 50%的 [C2Py]Cl、[C4Py]Cl、[C6Py]Cl溶液放在10.0 mL小試管中，用移液槍逐滴向小試管中滴加質量分數為35%的K2HPO4溶液，用旋渦混合器振蕩，觀察到體系出現渾濁點為止。在分析天平上稱量后計算出氯代吡啶類離子液體溶液和K2HPO4溶液在渾濁點時對應的質量分數。隨后向已渾濁的雙水相體系中逐滴加入超純水，觀察到體系又變澄清為止，即出現清點。準確稱量后，再向試管中滴加質量分數為35%的K2HPO4溶液，至體系再次變渾濁為止。依次交替加入超純水和K2HPO4溶液，計算每一個清點、濁點對應的質量分數。

1.3.2 雙水相相平衡的測定

參照盧艷敏等[15]方法，根據三角相圖選取適當質量分數的點配制雙水相體系。在25℃的恒溫環境下，分別量取不同質量的氯代吡啶類離子液體溶液和K2HPO4溶液加到10.0 mL離心管中，隨后補加超純水，在旋渦混合器中振蕩30 min，在該環境溫度下放置2.0 h，待溶液上下相分相清晰，確保體系達到完全平衡。按照參考文獻[16]中所述，用折射率來確定雙水相體系上下相的氯代吡啶類離子液體的質量分數，通過酸堿中和滴定法[17]來確定兩相中K2HPO4的質量分數。

折射率n、氯代吡啶類離子液體的質量分數wil、K2HPO4的質量分數ws，三者關系式如下：

式中：a0、a1、a2為方程參數，見表1。

表1 [CnPy]Cl-K2HPO4雙水相方程式（1）參數Table 1 Parameters of equation（1）for[CnPy]Cl-K2HPO4 aqueous two-phase system

1.3.3 氯代吡啶類離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶及蛋白濃度的測定

參照邵琳琳等[18]方法，根據三角相圖選取適當質量分數的點配制雙水相體系。向10.0 mL離心管中加入氯代吡啶類離子液體溶液和K2HPO4溶液，使雙水相體系的總體積為1.0 mL。再加入質量濃度為2.0 mg/mL（木瓜蛋白酶的質量/雙水相體系總體積）酶溶液，調節體系pH值為7.0，旋渦混合器中振蕩30 min，在25℃溫度下放置2.0 h，使溶液上下相完全分相。將上、下相液分離并準確讀取體積。用超純水將上、下相液均稀釋10倍，備用。吸取1.0 mL的待測溶液轉移到10.0 mL試管中，再向試管中加入5.0 mL考馬斯亮藍（G-250）染色液，充分振蕩使之混勻。設置空白對照組，不加酶溶液，在595 nm波長處比色，讀取吸光值A，計算木瓜蛋白酶的蛋白含量[19]。由于實際操作過程中僅添加了較少量的木瓜蛋白酶，對折射率的測定影響較小，相對誤差小于0.2%，所以使用該方法測定組分含量的結果準確。

以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白，測定其溶液在不同濃度下的吸光度值，繪制BSA-Abs標準曲線。曲線公式為：y=0.013 6+0.004 5x，R2=0.998 1，符合質量分析標準，結果見圖1。

圖1 BSA-Abs標準曲線Fig.1 BSA-Abs standard curve

1.3.4 數據處理及分析

采用Origin8.5處理試驗數據，每組處理均做3次重復。

2 結果與分析

2.1 體系雙節線數據的關聯及三角相圖的繪制

試驗中運用Merchuk方程關聯體系的雙節線數據，并繪制體系的三角相圖，Merchuk方程形式如下：

式中：a、b、c為方程擬合參數，利用濁點數據的最小二乘回歸算出；wil和ws分別代表[CnPy]Cl和K2HPO4的質量分數。Merchuk方程的形式簡單，較好地運用于離子液體/鹽雙水相體系的雙節線數據的關聯，且關聯效果較好[20]。分別以氯代吡啶類離子液體、K2HPO4、水為3個頂點，制作三角相圖，見圖2。

圖2 25℃溫度下[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4雙水相體系三角相圖Fig.2 Triangular phase diagram for[CnPy]Cl（n=2，4，6）-K2HPO4 system at 25℃

由圖2（a）、2（b）、2（c）可得，雙節線是單相區與雙相區的臨界線，表示雙水相達到平衡，雙節線左側是單相區，此時溶液是均一的相，無分層現象；右側是雙相區，它是無限多個不同濃度組成的兩相系統，上相是氯代吡啶離子液體富集相，下相是K2HPO4富集相。25℃時[CnPy]Cl-K2HPO4體系雙節點關聯結果見表2。

表2 25℃時[CnPy]Cl-K2HPO4體系雙節點關聯結果Table 2 Binodal correlation results of[CnPy]Cl-K2HPO4system at 25℃

由表2可知，試驗所得的雙節線數據能很好地滿足Merchuk方程，可為此體系雙水相相圖的繪制提供參考，且可根據相圖，選擇雙水相體系成相劑的濃度。

2.2 運用Othmer-Tobias方程和Bancroft方程擬合體系的液液相平衡關系

Othmer-Tobias方程和Bancroft方程近年來已經成功應用于擬合離子液體/無機鹽雙水相體系的液液相平衡關系，Othmer-Tobias方程和Bancroft方程的表達式分別如下[21]

式中：K、n、K'、n'為方程的參數，見表3；wilt代表上相離子液體的質量分數，wsb代表下相K2HPO4的質量分數；wwt、wsb分別代表上、下相水的質量分數。對方程兩邊取對數，在Othmer-Tobias方程中，以lg[（1-wwb）/wwb]為橫坐標，以lg[（1-wilt）/wilt]為縱坐標，進行擬合并繪制圖3。在Bancroft方程中，以lg[wwt/wilt]為橫坐標，以lg[wwb/wsb]為縱坐標，進行擬合并繪制圖4。式中，n、n'為斜率，lgK、lgK'為截距。

表3 [CnPy]Cl-K2HPO4雙水相方程式（3）和（4）中的參數Table 3 Parameters of Equation.（3）and（4）for[CnPy]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

圖3 Othmer-Tobias方程的線性相關性Fig.3 Linear dependency of Othmer-Tobias equation

從表3中的 R2值（＞0.995）可看出，Othmer-Tobias方程和Bancroft方程很好地擬合了試驗中的雙水相體系的液液相平衡數據。

由圖3、圖4可得，lg[（1-wwb）/wwb]與lg[（1-wilt）/wilt]，lg[wwt/wilt]與 lg[wwb/wsb]分別呈線性關系，表明相關性很好。

由相關參數和體系下相中各組分的質量分數可以計算出體系上相中各組分的質量分數。體系的液液相平衡數據見表4。

由表4可得，[C2Py]Cl、[C4Py]Cl和 [C6Py]Cl的平均相對誤差分別為：0.72×10-3%、-3.95×10-3%、0.75×10-3%；K2HPO4的平均相對誤差分別為：-0.65×10-3%、-2.20×10-3%、-1.13×10-3%。由此可得方程擬合結果較滿意。

圖4 Bancroft方程的線性相關性Fig.4 Linear dependency of Bancroft equation

2.3 分配模型的建立

離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶，酶的蛋白濃度分配系數K定義為：雙水相體系分相后，上、下相中各自的木瓜蛋白酶蛋白濃度的比值，公式如下

式中：Ct、Cb分別為上、下相中的木瓜蛋白酶蛋白濃度，mg/mL。

表4 25℃時[CnPy]Cl-K2HPO4雙水相體系的液液相平衡擬合結果Table 4 The result of liquid-liquid equilibrium for[CnPy]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system at 25℃

測定該體系上下相中木瓜蛋白酶濃度及各組分的含量，對上下相各組分含量和分配系數K之間的相關性進行分析，相關性越接近于1，說明相關性越好[22]，數據則可用于模型的建立；反之，相關性差不可用。選擇相關性接近1的一組或幾組數據，進行模型的建立。

變量x和y之間的相關性定義為：

木瓜蛋白酶的分配系數與參數的相關性見表5。

由表5可得，上下相離子液體濃度差、上下相鹽濃度差與lnK的相關性較高，均在0.75以上。

將上下相中氯代吡啶類離子液體的濃度差、上下相中K2HPO4的濃度差與該雙水相體系的lnK值進行關聯，得出如下公式：

式中：A、B、C為方程參數，L=（wil2+ws2）1/2（wil：上、下相中氯代吡啶類離子液體的濃度差；ws：上、下相K2HPO4的濃度差）。分別以[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4雙水相體系中的L值為橫坐標，以lnK值為縱坐標，利用K與L（系線的長度）[23]之間的相關性建立了模型。

模型的參數、分配系數的預測值與試驗值的相對偏差見下表6。

表5 分配系數與[CnPy]Cl-K2HPO4雙水相體系組分濃度的相關性Table 5 Correlation between partition coefficient and the components concentration of[CnPy]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

表6 模型的參數和分配系數預測值與試驗值的相對偏差Table 6 Parameters for models and relative deviations between predicted and experimental partition coefficient

由表6可得，與其他離子液體雙水相體系，如曹玲[24]研究的[Emim][（CF3SO2）2N]體系的分配模型（相對偏差為8.36%）相比，試驗建立的模型有更小的平均相對偏差。試驗值與計算值之間一致性良好，表明該模型預測能力很好。

木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶類離子液體雙水相體系中的蛋白濃度分配系數和上下相組分濃度差的關聯結果見圖5、圖6和圖7。

圖5 [C2Py]Cl-K2HPO4雙水相體系中木瓜蛋白酶的分配系數的實驗值與模型預測值Fig.5 Experimental value and predicted value of papain partition coefficient for[C2Py]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

圖6 [C4Py]Cl-K2HPO4雙水相體系中木瓜蛋白酶的分配系數的實驗值與模型預測值Fig.6 Experimental value and predicted value of papain partition coefficient for[C4Py]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

圖7 [C6Py]Cl-K2HPO4雙水相體系中木瓜蛋白酶的分配系數的實驗值與模型預測值Fig.7 Experimental value and predicted value of papain partition coefficient for[C6Py]Cl-K2HPO4aqueous two-phase system

由圖5～圖7可知，相關系數R2分別為0.985、0.993、0.981，結果較滿意。該模型的相對偏差均小于4%，并且與蔡濤[25]研究的[Cnmim]BF4-NaH2PO4咪唑類離子液體/鹽雙水相體系的分配模型（相對偏差5%）相比較小，表明本試驗建立的模型精確度得到進一步提高，并且能夠實現對木瓜蛋白酶在[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶類離子液體/鹽雙水相系統中分配系數K的準確預測。

3 結論

試驗在25℃條件下，利用清-濁點輔助法測定了[CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4氯代吡啶類離子液體/鹽雙水相體系的雙節線數據及液液相平衡數據，并繪制該體系的三角相圖。用Merchuk方程、Othmer-Tobias和Bancroft方程擬合數據，相關系數R2均達到0.995以上，平均相對誤差均低于0.1%，結果表明試驗數據的擬合效果很成功。進一步用 [CnPy]Cl（n=2、4、6）-K2HPO4雙水相體系探討不同碳鏈長度的氯代吡啶類離子液體對木瓜蛋白酶的分配系數的影響規律，建立的模型可較好地預測不同碳鏈長度的氯代吡啶類離子液體對木瓜蛋白酶的萃取能力，補充了酶在雙水相系統的分配模型數據庫。