PTEN、TRA2B在人低分化胃腺癌中的表達及其意義

靳俊峰 劉銀花 歐小波 阮媛 王海青 陳燕玲 吳秀香 易華

1遵義醫學院珠海校區（廣東珠海 519041）；2廣州中醫藥大學基礎醫學院（廣州 510006）

胃癌是消化系統的常見惡性腫瘤之一，也是引起癌癥性相關死亡的第三大癌癥類型。低分化胃癌對人體的健康危害尤其嚴重。許多的研究表明，腫瘤與基因突變有關，突變的基因是胃癌發生發展的重要原因之一。促癌基因（Transformer?2 protein homolog beta，TRA2B）屬于SR相關蛋白家族，富含絲氨酸/精氨酸，通過參與前體mRNA的選擇性剪接，達到調控基因表達的目的，進而影響疾病及某些惡性腫瘤的發生發展［1］。抑癌基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chro?mosome ten，PTEN）是P53基因外最重要的腫瘤抑制基因之一，參與細胞周期和多種信號途徑的調控，在腫瘤細胞浸潤、轉移、血管生成等方面發揮重要作用，與人類多種惡性腫瘤的發生發展密切相關［2-3］。但PTEN在低分化胃癌發生、發展及轉移中作用尚不清楚。本研究通過研究低分化胃癌組織中PTEN和TRA2B的表達情況，為進一步揭示胃癌的發病機制、診斷及預后評估提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2013-2016年低分化胃癌患者手術存檔蠟塊9例（來自遵義醫學院第五附屬醫院病理科），病理標本均為胃癌組織及同一患者的癌旁正常組織，病理診斷結果經本院病理科2名以上病理醫師確認均為低分化腺癌。所有患者均有明確的手術時間，術前均未接受化療和放療等抗癌治療，其中男6例，女3例，年齡40～68歲，中位年齡54歲。臨床分期參照國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）與美國腫瘤聯合會（American Joint Committee on Can?cer，AJCC）TNM分期系統（第七版），Ⅰ-Ⅱ期7例，Ⅲ-Ⅳ期2例。Dukes分期，證實有淋巴結轉移6例，無轉移3例。

1.2 試劑及儀器 Ⅰ兔抗人PTEN多克隆抗體（bs?0748R，北京博奧森生物技術有限公司）、兔抗人TRA2B多克隆抗體（ab50846，abcam公司），羊抗兔IgG（SP?0022，北京博奧森生物技術有限公司）、羊抗兔IgG?FITC（SA1064，武漢博士德生物技術有限公司），核標記物 Propidium iodide（PI，P4170，Sigma公司），DAB顯色試劑盒（C02?04001，北京博奧森生物技術有限公司），檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）（武漢博士德生物技術有限公司），日本產IX71奧林巴斯倒置光顯微鏡。

1.3 免疫組織化學染色及結果判定標準 采用SP兩步法染色（參照Invitrogen公司提供的試劑盒說明書進行免疫組化染色），石蠟切片常規脫蠟、水化；3%H2O2室溫孵育10 min；0.01 mmol/L PBS緩沖液（pH＝7.4，下同）沖洗3次×5 min；置pH＝6.0的檸檬酸緩沖液煮沸3 min，中火10 min，取出自然冷卻至室溫；PBS水沖洗3次×5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min；PBS緩沖液沖洗3次×3 min；滴加稀釋度1∶200的PTEN多克隆抗體稀釋度1∶200，4℃冰箱過夜；PBS沖洗3次×5 min，順序滴加生物素化Ⅱ抗和辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，DAB顯色3～5 min；流水沖洗5 min；蘇木素復染2 min，鹽酸酒精分化；自來水沖洗5 min；常規脫水、透明、中性樹膠封片。根據Ⅰ抗試劑產品說明書選用以PTEN陽性的標本作為陽性對照，PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。

PTEN結果判定：棕黃色及棕褐色顆粒者為陽性細胞，測定時采用雙盲法，由2名經驗豐富的病理科醫師在200倍光鏡下隨機選擇5個視野進行觀察。陽性細胞數＜25%為陰性（-）、≥25%為陽性（+）。

1.4 免疫熒光染色及結果判定 采用SP兩步法染色（參照Invitrogen公司提供的試劑盒說明書進行免疫熒光染色），石蠟切片常規脫蠟、水化；3%H2O2室溫孵育10 min；0.01 mmol/L PBS緩沖液（pH＝7.4，下同）沖洗 3次×5 min；置pH＝6.0的檸檬酸緩沖液煮沸3 min，中火10 min，取出自然冷卻至室溫；PBS水沖洗3次×5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min；PBS緩沖液沖洗3次×3 min；滴加稀釋度1∶200的TRA2B多克隆抗體，4℃冰箱過夜；PBS沖洗3次×5 min，滴加Ⅱ抗羊抗兔FITC（1∶100），室溫孵育60 min；PBS沖洗3次× 5 min；滴加PI染核1 min，PBS沖洗3次× 5 min；甘油封片。

標本組織中出現綠色熒光視為陽性結果，PI染核呈紅色。根據Ⅰ抗試劑產品說明書選用以TRA2B陽性的標本作為陽性對照，PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。

1.5 統計學方法 采用SPSS 23.0統計軟件進行數據處理。計數資料采用χ2檢驗。定量資料正態分布的數據用均數±標準差表示。定性資料用率表示，差異性檢驗采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，相關性分析采用Spearman檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PTEN在低分化胃癌組織中的表達 PTEN蛋白主要定位表達于細胞質，少數表達于細胞核，陽性產物染色呈棕黃色或棕褐色。PTEN在低分化胃癌組織中陽性表達弱于正常胃組織（圖1）。低分化胃癌組織中PTEN陽性率為77.8%，低于癌旁組織的88.9%，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 PTEN在正常胃組織及低分化胃癌組織中的表達Fig.1 The expression of PTEN in normal stomach tissue and low differentiated gastric cancer tissue

表1 PTEN在正常胃組織及低分化胃癌組織中表達的陽性率Tab.1 The positive rate of PTEN in normal stomach tissue and low differentiated gastric cancer tissue

2.2 TRA2B在低分化胃癌組織中的表達 TRA2B蛋白主要表達于細胞核中，少量表達于細胞質。TRA2B在低分化胃癌細胞核中表達明顯，但在正常胃組織中表達較弱（圖2）。低分化胃癌組織中TRA2B陽性率為66.7%，正常胃組織中TRA2B陽性率為22.2%，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

圖2 TRA2B在正常胃組織及低分化胃癌組織中的表達Fig.2 The expression of TRA2B in normal stomach tissue and low differentiated gastric cancer tissue

表2 TRA2B在正常胃組織及低分化胃癌組織中表達的陽性率Tab.2 The positive rate of TRA2B in normal stomach tissue and low differentiated gastric cancer tissue

2.3 低分化胃癌組織中PTEN蛋白表達水平、TRA2B蛋白表達水平與臨床病理特征的關系 對于低分化胃癌中PTEN和TRA2B蛋白的表達與患者的年齡、性別、TNM分期之間差異均無統計學意義（P＞0.05），但PTEN和TRA2B蛋白的表達與低分化胃癌的淋巴結轉移有相關性（P＜0.05）。

2.4 胃癌中PTEN和TRA2B表達相關性分析 胃癌組織中PTEN和TRA2B表達不具有相關性（P=1）。

表2 PTEN、TRA2B蛋白表達與低分化胃癌臨床特征的關系Tab.2 The relationship between the expression of PTEN and TRA2B protein and low differentiated gastric cancer clinic pathologic feature

3 討論

胃癌是一種由多步驟引起、多基因參與的惡性腫瘤，腺癌是其主要的病理學類型，其中中低分化腺癌對人類健康危害尤其嚴重。本研究發現PTEN基因作為重要的抑癌基因之一，在胃中低分化腺癌中表達與正常胃組織相比明顯降低，其表達在年齡、性別、TNM分期方面差異無統計學意義，但與淋巴結轉移有相關性，且統計學上呈負相關關系，提示PTEN基因可能參與了胃癌的發生、發展過程。既往的研究表明，胃癌組織中PTEN蛋白的表達存在缺乏或者異常，可能與胃癌的發生及生物學行為有關［5］。本研究結果與以往的研究結果相一致，胃低分化腺癌PTEN蛋白表達明顯低于正常胃組織，表明其與胃癌的發生有一定的關系。

表3 低分化胃癌組織中PTEN和TRA2B蛋白的關系Tab.3 The relationship between the expression of PTEN and TRA2B protein in low differentiated gastric cancer

TRA2B（又稱SFRS10）是一個 SR（Serine/Argi?nine?rich proteins）相關蛋白，定位于人類3號染色體長臂，編碼Tra2β蛋白，其N端和C端富含高度磷酸化的精氨酸/絲氨酸富含結構域（arginine/ser?ine?rich domain，RS結構域），通過與RRM結構域的特異性識別，將剪接因子聚集到前體mRNA的特異性剪接位點，實現對前體mRNA的選擇性剪接［6-9］。既往的研究表明，TRA2B可表達于正常人體組織，也參與了很多疾病的發生和發展，在宮頸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結腸癌［10-12］等多種惡性腫瘤中也呈現高表達，但在胃中低分化腺癌中的表達及臨床意義研究不多，相關問題尚未闡明。本研究發現，TRA2B在胃低分化腺癌中表達強度明顯增強，遠高于正常胃組織。TRA2B蛋白表達與年齡、性別在統計學上無明顯差異，而與TNM分期、淋巴結轉移差異有統計學意義。

PTEN基因是人體內除了P53基因外，最廣泛存在于人體的抑癌基因，在人體中發揮著重要的作用，參與腫瘤的發生、增殖、浸潤、轉移［13-14］等多個過程，其調節胃癌的機制非常復雜［15］，而TRA2B基因是癌基因，既往的研究也表明，參與了多種癌癥的發展和轉移［10-12］，但是關于二者之間的相關性研究卻鮮有報道。本研究發現，在胃低分化腺癌中，PTEN和TRA2B的表達有相關性，統計學上呈負相關，表明二者在胃低分化癌中可能存在協同關系。

本研究樣本量較少，對PTEN和TRA2B二者的關系研究不夠深入等不足，并且對于PTEN和TRA2B在低分化胃癌發展轉移中的具體作用機制尚不夠明確，仍需通過進一步的體內外實驗來闡明具體的分子作用機制。