Reversine對小鼠乳腺癌4T1細胞增殖和凋亡的調控及相關作用機制的研究

黃迪 黃宇 翁杰鋒 黃子圣 麥振豪 趙俐 古維立

1廣州醫科大學附屬廣州市第一人民醫院普通外科（廣州510180）；2廣州消化疾病中心（廣州510180）；3華南理工大學第二附屬醫院普通外科（廣州510180）

乳腺癌是一種嚴重危害女性健康的常見惡性腫瘤。近40年來，乳腺癌的發病率位居全球首位，全球每年有140萬婦女被確診為乳腺癌［1］。近幾十年來，盡管放療、化療及多種生物治療手段有了長足發展，然而，乳腺癌轉移、復發及化療耐藥等仍是乳腺癌治療的難題。有證據表明［2-4］，reversine可以抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，但是目前國內應用reversine作用乳腺癌的研究極為少見，特別是用于三陰性乳腺癌41T細胞的研究尚未見報道。因此，本研究旨在探討rever?sine對小鼠乳腺癌4T1細胞的增殖和凋亡的影響，并探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 小鼠乳腺癌4T1細胞株（中山大學動物實驗中心）；藥物reversine（SIMGA公司）；CCK?8試劑盒（上海東仁化學科技有限公司）；DMEM培養基干粉、胎牛血清、DMSO（美國Sigma公司）；TGF?beta、TIMP1、MMP9抗體（Abcam公司）；Caspase?3、bax、bcl?2 抗體（Cell Signaling公司）；Aurora B 抗體（Novusbio公司）；Annexin?V?FITC/PI凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；RIPI裂解液（碧云天生物技術公司）；Millipore聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、電化學（ECL）發光液、垂直電泳槽、Western blot電泳儀、Western blot轉膜儀、FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）；多功能酶標儀（香港基因有限公司）；IX51倒置相差顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組 4T1細胞用體積分數為10%胎牛血清加1%雙抗的高糖DMEM培養基，于二氧化碳培養箱（37℃，5%CO2）中培養，隔天換液，傳代時間為3～4 d，傳代前用2.5 g/L的胰酶消化。以加入DMSO的4T1細胞作為正常對照組；以reversine終濃度分別為 10、25、50 μg/mL 為實驗組，每組藥物干預時間為24 h。

1.2.2 CCK?8法檢測 取對數期生長的細胞，設立空白對照組，24 h后加入CCK?8試劑，與培養基按1∶10的比例加入，于培養箱中培養1 h后，多功能酶標儀檢測波長為450 nm處的吸光度OD值。實驗重復3次。細胞抑制率計算方法：細胞抑制率=1-（加藥組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測 取對數期生長的細胞，按照分組情況加入藥物干預，24 h后胰酶消化收集細胞，1×PBS洗滌細胞2次，制成細胞懸液，用300目濾網過濾，收集濾液，計數取1×105個細胞，離心后用500 μL的Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V?FITC以及5 μL PI，混勻，室溫避光反應15 min，1 h內完成檢測。每組實驗重復3次。

1.2.4 Western blot檢測 分別收集各組細胞，提取蛋白質后，進行SDS?PAGE電泳（分離膠10%，濃縮膠5%），每孔加入50 μg蛋白質，恒壓100 V電泳至分離膠底部，轉移到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶室溫封閉1 h，按照抗體說明書稀釋抗體，4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，每次15 min。再加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫搖床振搖1 h，PBST洗滌3次，ECL試劑顯色、曝光并拍照，掃描后用Image?Pro?Plus圖像分析軟件進行光密度積分值（Integral of optical density）分析。

1.3 統計學方法 運用SPSS 13.0軟件，多組間均數差異性比較采用單因素方差分析（One?way ANOVA），數據均以±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 reversine對小鼠乳腺癌4T1細胞的增殖抑制作用 如圖1所示，隨著濃度的增加，reversine對4T1細胞的抑制率也隨之增加，在同一濃度下，reversine干預48 h比干預24 h對細胞的抑制更強，呈現時間劑量對應關系。不同濃度reversine對細胞形態的影響見圖2。

圖1 reversine對小鼠乳腺癌4T1細胞的增殖抑制作用Fig.1 Effect of reversine on proliferation of mouse breast cancer 4T1 cells

2.2 reversine對小鼠乳腺癌4T1細胞凋亡率的影響 流式細胞檢測凋亡結果如圖3，不同濃度reversine對小鼠乳腺癌4T1細胞早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率的情況見表1。低濃度組（10 μg/mL）細胞早期、晚期以及總凋亡率有所增加，但是差異無統計學意義。中濃度組（25 μg/mL）及高濃度組（50 μg/mL）細胞早期、晚期以及總凋亡率明顯增加，與對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 Caspase?3、bax、bcl?2 蛋 白 表 達的變化Western blot檢測各組細胞中 Caspase?3、bax、bcl?2蛋白表達如圖4所示，利用IPP圖像分析軟件對各蛋白條帶定量，結果（圖5）應用reversine能夠顯著增加活化的Caspase?3的表達，隨著加藥濃度的增加bax/bcl?2的比值也增大。

圖2 reversine對4T1細胞形態的影響Fig.2 Effect of reversine on mouse breast cancer 4T1 cells

圖3 reversine對小鼠乳腺癌4T1細胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of reversine on apoptosis of mouse breast cancer 4T1 cells

表1 不同濃度reversine對小鼠乳腺癌4T1細胞早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率的影響Tab.1 Flow cytometry was adopted to detect the effect of reversine on the apoptosis of mouse breast cancer 4T1 cells

圖4 Western blot檢測各組細胞中Caspase?3、bax、bcl?2蛋白的表達情況Fig.4 Western blot was conducted to detect the expression of Caspase?3，bax，bcl?2 protein

圖5 活化的Caspase?3和bax/bcl?2比值定量分析情況Fig.5 Expression of Caspase?3 and bax/bcl?2 ratio of reversine on mouse breast cancer 4T1 cells

2.4TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白表達情況 Western blot檢測各組細胞中TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白表達（圖6），利用IPP圖像分析軟件對各蛋白條帶定量，結果（圖7）發現應用reversine后 TGF?β1表達無差別，rever?sine能夠下調4T1細胞中TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白的表達，差異有統計學意義（P＜0.01）。

3 討論

Reversine是一種人工合成的小分子的嘌呤衍生物，它可以令已分化的細胞轉變為未分化的祖細胞［5］，這一特性使得該藥物在再生醫學方面受到廣泛關注［6-10］。近年來研究發現reversine在體外細胞實驗具有抗腫瘤作用，對甲狀腺癌細胞［2，4］、口腔鱗狀細胞癌［3］、宮頸癌［11］、骨髓癌［12］等的治療具有一定作用。

圖6 Western blot檢測各組細胞中TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白的表達情況Fig.6 Western blot was conducted to detect the expression of TGF?β1，TIMP1，MMP9 and Aurora B protein

4T1細胞是一種雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體-2（Her?2）均為陰性的乳腺癌細胞。三陰性乳腺癌發病年齡小，最具侵襲性、轉移率高且預后不良，常規標準的化療治療預后較差，仍為臨床上治療的難點。雖現階段研究發現具有BRCA1/2基因變異的三陰性乳腺癌應用鉑類效果較佳，但三陰性乳腺癌仍為當今乳腺癌治療的挑戰。本研究利用reversine對小鼠乳腺癌4T1細胞進行體外實驗，結果發現reversine可以抑制小鼠乳腺癌4T1細胞的增殖，高濃度組（50 μg/mL）處理48 h后，50%的細胞生長受到抑制。Aurora B是一種促進細胞有絲分裂的關鍵蛋白，既往針對reversine的研究發現該藥物是通過Aurora B這一通路使細胞去分化。本實驗中west?ern blot檢測發現reversine能顯著下調4T1細胞Aurora B蛋白的表達來抑制細胞增殖。流式細胞術結果發現reversine可以促進4T1細胞凋亡，其作用機制與促進活化的 Caspase?3 表達、增加 bax/bcl?2比值有關。

圖7 TGF?β1、TIMP1、MMP9和Aurora B蛋白定量分析Fig.7 Expression of TGF?β1，TIMP1，MMP9和Aurora B protein of reversine on mouse breast cancer 4T1 cell

乳腺癌轉移是多步驟發展的過程，表現為：具有侵襲轉移能力的乳腺癌細胞脫離原發灶開始浸潤周圍組織，穿透血管壁進入血液，通過血液循環進行遠處轉移，最后在遠處器官上形成新的轉移灶。現階段的研究發現影響乳腺癌轉移的因素包括轉化生長因子-β（TGF?β）、基質金屬蛋白酶（MMPs）、組織金屬蛋白酶抑制物（TIMPs）和外泌體等。轉化生長因子TGF?β1是人體組織細胞內具有調控功能的細胞因子，在細胞增殖及凋亡中發揮重要的調節作用［13］，既往的研究也發現rever?sine對細胞的作用機制與TGF?β1相關［14］。有研究表明TGF?β1的表達與多種惡性腫瘤的進展和預后有關［15-17］。本研究發現reversine對4T1細胞TGF?β1的表達沒有影響。腫瘤的侵襲轉移是其難以根治的主要原因，基質金屬蛋白酶MMPs與TIMPs間活性的平衡決定著細胞外基質（ECM）降解與否。有研究表明，MMP9和TIMP1表達失衡與乳腺癌浸潤及淋巴結轉移密切相關［18-19］，乳腺癌組織中的TIMP1含量越高其預后越差［20］。本研究通過應用reversine干預4T1細胞，了解reversine作用乳腺癌的相關機制，結果顯示reversine可以顯著減低4T1細胞中MMP9和TIMP1蛋白的表達，提示re?versine有可能通過下調乳腺癌細胞中MMP9和TIMP1蛋白的表達來減少細胞侵襲，但具體通路尚待進一步研究。

綜上所述，reversine可以抑制小鼠乳腺癌4T1細胞的增殖，誘導細胞凋亡，reversine可能成為一種治療乳腺癌的潛在藥物，其具體的機制仍有待進一步研究。