上調海馬miR?107水平改善阿爾茨海默病模型鼠學習記憶損傷

王雪銀 李宜培

河南醫學高等專科學校微生物與免疫學教研室（鄭州 451191）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類非編碼的小分子RNA，能夠通過和靶基因mRNA的3′UTR段結合抑制其蛋白質的表達發揮作用［1］。人源miR?107最早被證實作為一個關鍵的調控因子參與糖的代謝［2］。近來的研究表明miR?107在早期的阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）患者腦中表達下降，與AD特征性的病理特征神經纖維纏結和炎性斑塊的水平呈負相關［3］，并且miR?107還能通過調控淀粉樣蛋白剪切酶BACE1的功能，加劇AD患者的記憶力損傷［4］。此外，β淀粉樣蛋白（amyloid β?protein，Aβ）轉基因小鼠的研究證實miR?107參與了絲氨酸蛋白水平的調節和棒狀結構的形成［5］。以上的研究結果說明miR?107可能參與了AD的病理過程，影響了其學習記憶能力，但是具體的分子機制現在還不清楚。為了探討miR?107在AD病理過程中的具體機制以及對AD導致的學習記憶障礙的作用，本研究利用立體定位注射系統在AD模型鼠海馬區上調miR?107的表達水平，并檢測其對AD模型鼠突觸相關蛋白NMDA受體2B（NR2B）和谷氨酸受體1（GluR1）以及學習記憶損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 miR?107表達慢病毒顆粒有本室包裝和保存。293FT（人胚腎細胞）購自美國ATCC中心，由本室傳代并保存。IMDM（含GlutaMAX）、FBS、MEM Non?Essential Amino Acids（NEAA）、GlutaMAX I、TrypLE express、雙抗、Neurobasal、B27購自Gbico公司，NR2B一抗、GAPDH抗體購自Ab?cam公司。BCA蛋白測定試劑盒，免疫印跡的二抗Odyssey Second antibody購自Pierce公司。硝酸纖維素膜（NC）購自Hybond公司，轉基因小鼠墊料食物購自北京華阜康。AD模型鼠由本室飼養保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及病毒注射 選取6～8個月齡的雄性AD模型鼠，實驗動物分為miR?107表達病毒組（病毒組）和空載體病毒組（對照組）。利用腦立體定位技術，采用微量注射系統將病毒顆粒注射AD鼠雙側海馬區域，2周后進行后續實驗。

1.2.2 定量PCR Trizol法提取AD模型鼠海馬組織的總RNA，超微量全波長分光光度測RNA濃度及純度，1%的瓊脂糖凝膠電泳確定RNA形態之后，用 All?in?One First?strand cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄合成 mRNA 的 cDNA，然后用 All?in?One miRNA qRT?PCR Detection Kit進行Real Time PCR檢測miRNA的表達水平，以U6 snRNA為內參，2-ΔΔCT對樣品進行基因表達分析。

1.2.3 Western blot 病毒感染2周后分別提取病毒組和對照組小鼠海馬組織蛋白，常規處理蛋白樣品后，取兩組蛋白樣品各30 μg進行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，將分離后的蛋白采用半干法電轉移至硝酸纖維素膜，NR2B和GluR1的一抗4℃進行孵育過夜，二抗室溫避光孵育，洗膜3次后Odensey激光紅外掃描儀掃膜檢測蛋白水平。

1.2.4 Morris水迷宮 病毒感染2周后，采用Morris水迷宮進行行為學檢測空間學習記憶能力。實驗時間為定位航行訓練6 d，休息1 d，第7天空間搜索檢測。設定潛伏期為90 s，定位航行階段記錄潛伏期，空間搜索階段記錄穿越平臺次數。實驗分組：實驗動物分為兩組，每組15只動物。病毒組為AD模型鼠海馬區注射miR?107病毒；對照組為AD模型鼠海馬區注射空載體對照病毒。

2 結果

2.1 慢病毒上調AD模型鼠海馬區miR?107水平為了檢測感染病毒后AD模型鼠的miR?107水平，利用定量PCR法檢測了病毒感染2周后兩組小鼠海馬組織的miR?107的水平。定量PCR結果示，與對照組比較，病毒組AD鼠海馬區miR?107的表達水平顯著上調（圖1）。上述結果證實可以通過海馬區注射miR?107過表達慢病毒顆粒，有效地上調AD模型鼠腦內的miR?107水平。

圖1 定量PCR法檢測病毒感染后AD鼠海馬區miR?107的表達水平Fig.1 The expression of miR?107 in hippocampus of AD mice was detected by quantitative PCR after virus infection

2.2 上調海馬miR?107增加突觸相關蛋白水平為了檢測miR?107對AD模型鼠突觸相關蛋白的影響，利用過表達病毒上調了海馬區miR?107水平后，檢測了NR2B和GluR1的表達水平，結果顯示，與對照組相比，上調海馬區miR?107水平后，病毒組AD模型鼠海馬區NR2B和GluR1的蛋白水平顯著上調（圖2）。NR2B和GluR1的表達水平對于學習記憶的功能具有重要作用，所以上述結果提示增加的NR2B和GluR1可能參與miR?107影響學習記憶的分子機制。

2.3 上調miR?107減輕AD模型鼠學習記憶障礙 為了確認上調海馬區miR?107水平對AD模型鼠學習記憶障礙的影響，利用Morris水迷宮的方法檢測了病毒組和對照組AD模型鼠的空間學習記憶能力。結果顯示，與對照組相比，上調海馬區miR?107水平后，病毒組AD模型鼠在學習階段的潛伏期顯著縮短，說明其學習的能力明顯增強（圖3A）。而在穿越平臺的次數檢測中同樣顯示了記憶能力的明顯改善，與對照組相比，病毒組AD模型鼠穿越平臺的次數明顯增加（圖3B）。

圖2 免疫印跡檢測上調miR?107后NR2B、GluR1的表達水平Fig.2 The expression of NR2B and GluR1 were tested by Western blot after miR?107 was upregulated

圖3 Morris水迷宮檢測Tg2576小鼠空間學習記憶能力（n=15）Fig.3 The spatial learning and memory of Tg2576 mice detected by Morris water maze test

3 討論

AD是一種極大危害人類健康的神經退行性疾病，主要臨床表現為記憶障礙、人格和行為異常，最顯著的病理變化包括神經纖維纏結［6］、淀粉樣蛋白變性［7］、神經和血管的大量丟失［8］和血腦屏障完整性損傷［9］等。臨床上一直缺乏有效的治療藥物，而各個研究機構開發的一系列新的有望改善AD病理變化的靶點藥物，包括小分子的siRNA和miRNA藥物［10］。

miRNA屬于非編碼RNA，其作用方式是和靶蛋白的mRNA 3′UTR端互補結合導致蛋白表達抑制或者mRNA降解，由于其能夠通過調控多種蛋白質的表達水平而參與疾病的病理過程成為近年來研究的熱點［11］。研究表明AD患者腦脊液中的部分miRNA的表達會發生明顯的異常［12］。miRNA對AD發生發展的影響涉及到對APP、BACE1、神經元的凋亡等多環節的調控作用［13］。miR?107是一種富含于腦內組織的miRNA，在早期AD發病進展中在顳葉皮層灰質區表達活性降低，鄰近大腦組織中神經元血小板的計數和神經元纖維纏結數的增加與miR?107的表達水平降低有關［14］。研究證實，AD病理過程重要的致病因子Aβ可通過降低miR?107的表達水平損傷血腦屏障的完整性［15］。上述結果提示miR?107可能通過影響AD的病理過程而調控其學習記憶的能力，但是具體的調控機制仍不清楚。

為了探討miR?107對于AD模型鼠學習記憶損傷的影響，本研究通過立體定位系統，采用微量注射的方法通過miR?107表達病毒特異性的提高AD模型鼠海馬區miR?107的表達水平。然后通過一系列的方法檢測過表達miR?107對于AD模型鼠的影響。免疫印跡的結果提示過表達miR?107能夠顯著增加海馬區突觸相關蛋白NR2B和GluR1的水平，miRNA可以通過和目標基因的調控區序列或者調節一些轉錄因子的表達水平而改變相關蛋白的表達。本研究中沒有獲得miR?107直接調控NR2B和GluR1表達的證據，所以推測是通過調節某種轉錄因子的表達水平間接地上調了NR2B和GluR1的蛋白水平，這也將是筆者后續研究的主要內容。NR2B和GluR1均屬于谷氨酸受體家族成員，能夠通過影響突觸傳遞和可塑性調控學習記憶［16］，所以上調的NR2B和GluR1水平可以改善小鼠的學習記憶能力［16］。水迷宮是檢測小鼠學習記憶能力的最常用實驗方法，本研究的結果表明病毒組的AD小鼠在定位航行階段的潛伏期明顯縮短，證明該組小鼠的學習能力得到了改善，而在空間搜索階段穿越平臺位置的次數也顯著增加，說明了其空間依賴的記憶能力得到了明顯提高，具體的分子機制還有待于進一步的研究。國內外關于AD的研究大多數關注于減少能引起病理特征的β淀粉樣蛋白和Tau蛋白，本研究通過改變腦內特定miRNA水平，提高突觸相關蛋白的表達，最終改善了AD模型鼠的學習記憶能力。總之，本研究通過特異性上調AD模型鼠海馬區的miR?107表達水平，增加了學習記憶相關蛋白NR2B和GluR1的水平，改善了AD模型鼠的空間學習記憶能力，為AD藥物研發和臨床治療提供了新的思路。