腫瘤抑制基因PTEN對體外活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的影響

郝禮森 張明婷 王玉蘭 宋小杰 宋潔 章廣玲 莫艷波 靳麗敏張朋壘

1華北理工大學附屬醫院消化內科（河北唐山 063000）；2華北理工大學基礎醫學院（河北唐山 063000）

肝纖維化是肝臟對各種損傷產生的修復反應，持續發展可演變為肝硬化。而肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）則是肝纖維化病理過程中的最重要的細胞。當肝臟受到損傷因子刺激時，HSC活化為肌成纖維細胞，并向損傷區域遷移，產生大量以膠原為主的細胞外間質，導致肝纖維化的形成與發展［1］。因此，活化HSC的遷移在肝纖維化病理過程中發揮重要作用。已有研究證實細胞遷移與細胞骨架的重構有關［2-3］，而細胞骨架是由微絲、微管及中間纖維組成的蛋白纖維網狀結構，其中微絲是由肌動蛋白（actin）構成的螺旋狀纖維。Actin作為構成微絲的重要骨架蛋白，其功能除了參與維持細胞的正常形態外，還參與對細胞黏附、遷移的調控［4］。紐蛋白（vinculin）是一種與黏著連接形成有關的細胞骨架蛋白，存在于細胞-細胞及細胞間質間的黏著部位，因此也是一種黏著斑蛋白，其作用是將纖維狀肌動蛋白（filamentous actin，F?actin）錨著于連接點形成部位的細胞膜上，通過與多種細胞骨架蛋白、黏著斑蛋白相互作用，在細胞黏附、遷移、增殖等過程中發揮重要作用［5-6］。第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homology detected on chromosome ten，PTEN）是第一個被發現的具有雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，其突變或表達缺失與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關［7］。本課題組前期發現，膽總管結扎肝纖維化大鼠肝組織及在體肝星狀細胞的PTEN表達降低［8］；并且體外研究發現，野生型PTEN過表達可顯著抑制體外活化大鼠肝星狀細胞骨架的重構及細胞骨架蛋白F?actin的形成［9］，而PTEN表達下調則可明顯促進體外活化大鼠肝星狀細胞骨架的重構及細胞骨架蛋白F?actin的形成［10］。但PTEN表達變化對活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的影響仍不清楚。為此，本研究以活化大鼠肝星狀細胞系HSC?T6為研究對象，分別將攜帶野生型PTEN基因及靶向PTEN的RNA干擾序列短發夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）的重組腺病毒 Ad?PTEN及Ad?shRNA/PTEN轉染體外活化大鼠HSC，構建體外活化大鼠肝星狀細胞PTEN過表達及低表達模型，應用免疫熒光法檢測了PTEN過表達及低表達對體外活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的影響，以期為深化對肝纖維化病理生理機制的認識提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因并攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒（Ad?PTEN）及僅攜帶GFP基因的空病毒（Ad?GFP）由祝善俊教授（第三軍醫大學）惠贈，帶有GFP基因并攜帶靶向PTEN的shRNA的重組腺病毒（Ad?shRNA/PTEN）由浙瑪生物技術公司（武漢）協助構建。表型活化的大鼠肝星狀細胞系HSC?T6（中國醫學科學院腫瘤醫院）；胎牛血清及山羊血清（以色列Biological Industries公司）；DMEM培養液（美國Gibco公司）；兔抗vinculin單克隆抗體（美國Affinity公司）；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的羊抗兔IgG（美國KPL公司）；DAPI及TritonX?100（美國Sigma公司）；熒光防淬滅封片劑（美國Bioworld公司）；Platinum SYBR Green qPCR SuperMix?UDG、逆轉錄反應體系（上海英俊生物技術有限公司）。

1.2 腺病毒轉染體外活化肝星狀細胞 以含8%胎牛血清的DMEM培養HSC?T6，細胞生長至80%融合時，按感染倍數100進行腺病毒轉染，并于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育2 h，2 h后補充適量完全培養基繼續培養至實驗所需時間。分別于倒置熒光顯微鏡下在腺病毒感染肝星狀細胞12、24、48、72 h觀察HSC的熒光表達、計算轉染效率。腺病毒感染肝星狀細胞48 h轉染效率＞80%，并且48與72 h GFP陽性表達的HSC數量無明顯差異，但72 h細胞脫落現象更廣泛，表明腺病毒感染肝星狀細胞48 h轉染效率已達到最高，故后續實驗僅采用腺病毒感染48 h的HSC。實驗分組：（1）Control組：以無血清無抗生素的DMEM培養液代替腺病毒液轉染體外活化HSC；（2）Ad?GFP組：以僅帶有GFP基因的載體空病毒Ad?GFP轉染體外活化HSC；（3）Ad?PTEN組：以帶有GFP基因并攜帶野生型PTEN基因的重組腺病毒 Ad?PTEN 轉染體外活化HSC；（4）Ad?shRNA/PTEN組：以帶有GFP基因并攜帶靶向PTEN的shRNA的重組腺病毒Ad-shRNA/PTEN轉染體外活化HSC。

1.3 實時熒光定量PCR檢測體外活化肝星狀細胞的PTEN mRNA表達 腺病毒感染肝星狀細胞48 h，收集各組肝星狀細胞，依照TRizol試劑盒說明提取總RNA，并逆轉錄合成cDNA。目地基因PTEN與內參照3?磷酸甘油醛脫氫酶（glyseralde?hyde?3?phosphate dehydrogenase，GAPDH） 基因引物由上海生工生物公司合成。引物序列：PTEN的上游引物為 5′?TCCTGCAGAAAGACTTGAAGGT?3′，下游引物為 5′?GCTGTGGTGGGTTATGGTCT?3′，擴增產物大小為182 bp；GAPDH的上游引物為5′?GGCTCATGACCACAGTCCAT?3′，下游引物為 5′?ACATTGGGGGTAGGAACACG?3′，擴增產物大小為202 bp。在Master cycler ep Real Plex4實時熒光定量PCR儀上進行擴增。采用相對定量2?△△Ct法比較各組HSC的PTEN mRNA表達差異［11］。

1.4 免疫熒光法檢測體外活化肝星狀細胞的vinculin表達 腺病毒感染肝星狀細胞48 h，將上述各組肝星狀細胞的培養液吸凈，用PBS清洗細胞2次，并加入4%多聚甲醛室溫下固定10 min，再吸去多聚甲醛并用PBS清洗3次（每次10 min）、加入0.5%TritonX?100室溫下透膜處理5 min；經透膜處理后，細胞于室溫條件下用PBS清洗3次（每次10 min），滴加山羊血清，室溫下封閉1 h；吸去封閉液，滴加一抗兔抗vinculin單克隆抗體（1∶200稀釋）于4℃下過夜；于次日用PBS清洗細胞4次（每次5 min）；加入熒光二抗（FITC標記的羊抗兔IgG），于室溫下孵育1 h；PBS清洗3次（每次5 min），用DAPI溶液（濃度5 mg/L）復染細胞核30 s，用PBS清洗細胞，在共聚焦小皿底部滴加熒光防淬滅甘油，并立即置于激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal micro?scope，LSCM）下觀察，隨機選取6個視野進行熒光圖像分析。

1.5 統計學方法 實驗結果以均數±標準差表示，采用SPSS 17.0進行統計學分析，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建體外活化大鼠HSC的PTEN過表達及低表達模型 應用實時熒光定量PCR檢測各組HSC的PTEN mRNA表達，Control組HSC的PTEN mRNA 表達量認定為 1，則 Ad?GFP組、Ad?PTEN組及Ad?shRNA/PTEN組HSC的PTEN mRNA相對Control組的表達倍數分別為0.92倍、1.90倍、0.64倍。很明顯Ad?PTEN組HSC的PTEN mRNA表達量明顯高于Control組及Ad?GFP組（P＜ 0.05），而Ad?shRNA/PTEN組 HSC的 PTEN mRNA表達量則顯著低于Control組及Ad?GFP組（P＜0.05），但Control組與Ad?GFP組之間HSC的PTEN mRNA表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。上述結果表明外源性野生型PTEN基因和靶向PTEN的shRNA分別成功轉染體外活化大鼠HSC，并在HSC內大量表達，體外活化大鼠HSC的PTEN過表達及低表達模型均成功構建（表1）。

表1 實時熒光定量PCR顯示腺病毒感染HSC 48 h各組HSC的PTEN mRNA相對表達Tab.1 PTEN mRNA expression of HSC in each group at 48 h after adenovirus infection ±s

表1 實時熒光定量PCR顯示腺病毒感染HSC 48 h各組HSC的PTEN mRNA相對表達Tab.1 PTEN mRNA expression of HSC in each group at 48 h after adenovirus infection ±s

注：△△Ct=腺病毒轉染組 △Ct（CtPTEN－CtGAPDH）－Control組 △Ct（CtPTEN－CtGAPDH）；*P＜0.05，與Control組及Ad?GFP組比較

組別Control組Ad?GFP 組Ad?PTEN 組Ad?shRNA/PTEN 組ΔCt 8.070±0.108 8.183±0.123 7.137±0.072 8.723±0.115 ΔΔCt 0 0.113-0.933 0.653 PTENmRNA相對表達量（2-ΔΔCt）1 0.92 1.90*0.64*

2.2 野生型PTEN過表達對體外活化大鼠HSC vinculin的影響 肝星狀細胞經染色后，于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，可見細胞內vinculin被激發出黃綠色熒光，主要表達于胞漿。Ad?PTEN組HSC的vincuin熒光強度較Control組及Ad?GFP組HSC的vincuin熒光強度顯著降低（P＜0.05），Control組與Ad?GFP組之間HSC的vinculin熒光強度差異無統計學意義（P＞0.05），而HSC的vincuin亞細胞分布在各組HSC無明顯變化（表2、圖1）。

2.3 下調PTEN表達對體外活化HSC vinculin的影響 肝星狀細胞經染色后，于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，可見細胞內vinculin被激發出黃綠色熒光。Ad?shRNA/PTEN組HSC的 vincuin熒光強度較Control組及Ad?GFP組HSC的 vincuin熒光強度顯著增加（P＜0.05），而HSC的vincuin亞細胞分布未發生明顯變化，主要表達于細胞漿（表2、圖1）。

表2 腺病毒感染HSC 48 h各組HSC的vinculin熒光強度Tab.2 The fluorescence intensity of vinculin in HSC at 48 hours after adenovirus infection（n=6） ± s

表2 腺病毒感染HSC 48 h各組HSC的vinculin熒光強度Tab.2 The fluorescence intensity of vinculin in HSC at 48 hours after adenovirus infection（n=6） ± s

注：與Control組及Ad?GFP組比較，*P＜0.05

組別Control組Ad?GFP 組Ad?PTEN 組Ad?shRNA/PTEN 組Vinculin熒光強度381.13±9.12 383.87±12.15 251.78±12.68*770.77±20.12*

3 討論

圖1 LSCM下顯示腺病毒感染HSC 48 h各組HSC的vinculin熒光表達及分布（×200）Fig.1 The expressions of vinculin in HSC were observed under LSCM at 48 hours after adenovirus infection（× 200）

細胞骨架是一種蛋白纖維網狀結構，位于真核細胞核和細胞膜內側面，由微絲、微管和中間纖維組成。細胞骨架的功能除了參與細胞形態的維持，還參與對細胞黏附、遷移、增殖、凋亡等的調控［4］。細胞骨架功能的完成與構成它的骨架蛋白密切相關，其中組成微絲的主要成份actin是完成細胞骨架功能不可缺少的重要骨架蛋白。而vinculin則是另一重要的細胞骨架蛋白，其由8個α螺旋束組成，存在于細胞—細胞及細胞間質間的黏著部位，因此也是一種黏著斑蛋白。Vinculin的功能與黏著連接形成有關，它可將F?actin錨著于連接點形成部位的細胞膜上，通過與多種細胞骨架蛋白及黏著斑蛋白相互作用，參與細胞黏附、伸展、遷移、增殖、存活等的調控［5-6］。

眾所周知，肝纖維化是肝臟對各種損傷產生的修復反映，HSC是參與肝纖維化病理過程中的最重要細胞。在肝纖維化過程中，活化HSC向肝損傷部位遷移，導致損傷區域活化HSC的數量增多，進而促進肝纖維化的發展。如上所述，細胞骨架，尤其是細胞骨架蛋白F?actin及vinculin與細胞遷移有關。我們前期的研究發現，在多種組織及細胞中廣泛表達的腫瘤抑制基因PTEN表達下調可顯著促進體外活化肝星狀細胞的遷移［12］，并明顯促進體外活化肝星狀細胞骨架的重構及細胞骨架蛋白F?actin的形成［10］；而野生型PTEN過表達則可顯著抑制體外活化肝星狀細胞骨架的重構及細胞骨架蛋白F?actin的形成［9］。但PTEN 表達變化對體外活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的影響尚不清楚。為此，本研究應用腺病毒瞬時轉染技術，將野生型PTEN基因及靶向PTEN的shRNA分別轉染體外培養的活化HSC，在證實活化HSC的PTEN過表達及低表達模型成功構建后，應用免疫熒光法檢測了PTEN過表達及低表達對體外活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的影響。結果顯示，野生型PTEN過表達可顯著抑制體外活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的表達，而PTEN低表達則可上調活化肝星狀細胞骨架蛋白vinculin的表達，但PTEN表達變化對體外活化HSC的vinculin亞細胞分布無明顯影響。結合我們前期的研究發現膽總管結扎肝纖維化大鼠肝組織及在體肝星狀細胞的PTEN表達降低［8］，體外研究發現PTEN表達下調可顯著促進體外活化肝星狀細胞的遷移［12］，以及有研究發現在大鼠肝纖維化進程中其纖維化肝組織的vinculin表達上調［13］，本研究結果提示在肝纖維化病程中PTEN表達下調可能通過使活化HSC的vinculin表達上調，進而促進活化HSC的遷移參與肝纖維化病理過程。如PTEN過表達則可通過下調活化HSC的vinculin表達抑制活化HSC的遷移，進而抑制肝纖維化的發展。但本研究為體外實驗，僅對體外活化HSC的PTEN表達變化對其vinculin的影響進行了探討，而在體HSC的PTEN表達變化對其vinculin的影響仍不清楚，并且盡管我們前期的研究已發現PTEN過表達可通過抑制絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B（serine?threo?nine protein kinase B，Akt）及黏著斑激酶（focal ad?hesion kinase，FAK）的磷酸化而抑制體外活化HSC的磷脂酰肌醇?3 激酶（phosphoinositol?3?kinase，PI3K）/Akt及FAK信號通路［14-15］，但上述信號通路是否參與了PTEN對HSC的vinculin調控仍需進一步探討，這些問題均是下一步的研究方向。