香椿種子無菌苗再生體系的建立

楊超臣，張 婷，朱天然，曹麗仙，李建安

（中南林業(yè)科技大學(xué) 經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

香椿Toona sinensis楝科Meliaceae香椿屬Toona(Endl.)Roem，是我國珍貴的速生用材樹種，素有“中國桃花心木”之美譽，也是園林綠化的優(yōu)良樹種，同時也是兼具營養(yǎng)價值、食用價值、藥用價值的木本蔬菜，主要采食其嫩葉和芽[1]。香椿作為木本蔬菜的栽培方式主要是設(shè)施栽培和矮化密植栽培[2]，其常規(guī)育種方法是根蘗繁殖和種子繁殖。由于香椿根系深，根量少，根蘗繁殖率低，且香椿種子自然條件下萌發(fā)率低。組織培養(yǎng)作為一種高效的無性繁殖技術(shù)，可以實現(xiàn)種質(zhì)資源創(chuàng)新和良種工廠化培育，現(xiàn)常與其他育種技術(shù)相結(jié)合，如：基因工程、原生質(zhì)融合和花藥培養(yǎng)等，是品種選育和種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要技術(shù)手段[3]。近年來，較多學(xué)者對香椿組培進行大量研究，但主要以帶芽莖段[4]、葉片[5]作為初代培養(yǎng)材料，以香椿種子為初始培養(yǎng)材料的研究報道較少。本研究以成熟香椿種子在無菌條件下萌發(fā)的幼苗為外植體，研究不同基本培養(yǎng)基和不同植物生長調(diào)節(jié)劑對叢芽誘導(dǎo)、增殖、壯苗及生根的影響，建立了完整的組培快繁體系，為香椿的工廠化育苗提供理論基礎(chǔ)，以期為遺傳轉(zhuǎn)化提供可能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

香椿Toona sinensis成熟種子來自河南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，常溫避光下保存，試驗在中南林業(yè)科技大學(xué)經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得

試驗材料預(yù)處理：挑選大小均勻一致、籽粒飽滿的成熟香椿種子，然后用洗衣粉浸泡10 min，在流水下沖洗2 h，再用40 ℃溫水浸泡催芽，浸種12 h后暗培養(yǎng)24 h。然后經(jīng)75%無水乙醇表面滅菌1 min后用無菌水沖洗4～5次。用以下3種材料滅菌處理：1%NaClO（有效成分）、0.1%HgCl2、10%H2O2，無菌水沖洗4～5次，充分去掉殘余的消毒液，然后將滅菌好的種子放在無菌濾紙上吸干水分，轉(zhuǎn)接至WPM培養(yǎng)基上。每個處理接種20瓶，每瓶1粒種子，重復(fù)3次，培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計污染率、萌發(fā)率。

1.2.2 培養(yǎng)基的篩選

把預(yù)處理的種子用1% NaClO滅菌處理20 min。分別接種在WPM、MS、1/2MS培養(yǎng)基上，并添加不同濃度GA3（0、3、5 mg·L-1）。每個處理接種15瓶，每瓶2粒種子，重復(fù)3次。統(tǒng)計萌發(fā)所用時間、成苗率，以胚根露出超過種子長度為萌發(fā)標準，觀察培養(yǎng)40 d后的幼苗生長情況。

1.2.3 叢生芽的誘導(dǎo)

選取培養(yǎng)45 d后長勢一致的香椿無菌苗為材料，切成長度為2.0 cm帶芽莖段，接入含有6-BA（0.5、1.0、2.0 mg·L-1）、NAA（0.05、0.1、0.5 mg·L-1）、GA3（1.0 mg·L-1）的培養(yǎng)基中進行叢芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，45 d后統(tǒng)計叢芽誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)。每處理接種20個帶芽莖段，重復(fù)3次。

1.2.4 無菌苗壯苗培養(yǎng)

以培養(yǎng)45 d的香椿叢芽為材料，培養(yǎng)基中添加6-BA（0.5、1.0 mg·L-1）、IAA（0.05、0.1、0.5 mg·L-1）、GA3（2.0 mg·L-1），優(yōu)化出壯苗培養(yǎng)基，45 d后統(tǒng)計苗高及生長情況。每處理接種20瓶，每瓶1～2個單芽，重復(fù)3次。

1.2.5 生根培養(yǎng)

以壯苗后的單個芽苗為材料，切取生長健壯（高度4 cm左右）的單個芽苗接種在含有IBA（0.1、0.5、1.0、2.0 mg·L-1）、NAA（0、0.1、0.5 mg·L-1）的生根培養(yǎng)基上，45 d后統(tǒng)計生根率、生根條數(shù)及根系生長情況。每處理15瓶，每瓶1～2個芽苗，重復(fù)3次。

1.2.6 煉苗移栽

將生根45 d的試管苗打開瓶蓋在人工氣候室中煉苗2 d，保持其濕度為65%左右。去掉根部的培養(yǎng)基，然后移栽到園土∶草炭土∶珍珠巖體積比為2∶2∶1的混合基質(zhì)中，移栽初期保持盆內(nèi)微環(huán)境相對濕度為75%～85%。30 d后統(tǒng)計移栽成活率[6]。

1.2.7 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基中均添加30 g·L-1蔗糖和7 g·L-1瓊脂，添加植物生長調(diào)節(jié)劑后調(diào)pH值為5.8。121 ℃高溫滅菌20 min。培養(yǎng)條件為：溫度25±2 ℃、光照周期12 h/d、光照強度為30 μmol·m-2s-1、相對濕度為60% ～70%。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用Excel 2016、SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均為“平均數(shù)±標準偏差”格式，采用Duncan’s新復(fù)極差測驗法（P＜0.05）進行顯著性分析。在結(jié)果統(tǒng)計中所涉及的測定項目計算公式如下：萌發(fā)率(%)＝萌發(fā)的種子數(shù)/(接種的種子數(shù)－污染的種子數(shù)) ×100%；污染率(%)＝污染種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；成苗率(%)＝成苗數(shù)/(接種的種子數(shù)－污染的種子數(shù))×100%；增殖倍數(shù)=增殖后獲得的單芽個數(shù)/接種的外植體數(shù)；生根率(%)＝生根的苗數(shù)/接種的芽苗數(shù)×100%；平均生根條數(shù)＝每處理生根的總根數(shù)/生根的總苗數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌處理對香椿種子萌發(fā)和污染情況的影響

由表1可知，A1～A13處理污染率明顯低于A14處理，說明各滅菌材料的不同處理時間都有滅菌作用，并且各處理的滅菌效果有差異，1%NaClO和0.1%HgCl2處理時隨著處理時間的延長，污染率降低，而10%H2O2處理時并沒有這種趨勢，其中處理A9的污染率最低，為3.33%。A1～A13處理萌發(fā)率明顯低于A14處理，說明滅菌處理對種子萌發(fā)有一定的傷害作用，其中除對照外，處理A12的萌發(fā)率最高，為87.37%。由表1知，相同滅菌時間下，0.1%HgCl2的滅菌作用要明顯好于1%NaClO和10%H2O2，但0.1%HgCl2處理的種子萌發(fā)率遠遠低于1%NaClO和10%H2O2，并達到顯著水平（P＜0.05）。因此，處理A4的滅菌效果最好，即用1%NaClO處理20 min，香椿種子污染率為25.00%，萌發(fā)率為82.32%。

2.2 不同培養(yǎng)基及添加不同GA3濃度對種子萌發(fā)的影響

不同培養(yǎng)基、不同GA3濃度的添加影響種子的初始萌發(fā)時間、成苗率和幼苗生長狀況，見表2。由表2可知，在同等激素水平下，以WPM和1/2MS作為基本培養(yǎng)基，成苗率差異不顯著（P＞0.05），但都顯著高于MS培養(yǎng)基（P＜0.05）。同一種培養(yǎng)基時，隨著添加GA3濃度的增加，初始萌發(fā)時間縮短，但濃度過高會使根系浮在培養(yǎng)基表面，不利于幼苗生長。因此，在WPM或1/2MS培養(yǎng)基上添加3.0 mg·L-1GA3，可以縮短香椿種子萌發(fā)時間，有利于幼苗生長（B4或B5組）。

表1 不同消毒劑和消毒時間對香椿種子消毒效果的影響?Table 1 Effect of different disinfection and sterilizing time on seeds of Toona sinensis

表2 不同培養(yǎng)基及添加不同GA3濃度對種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of different medium and GA3 concentration on seed germination

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對叢生芽誘導(dǎo)的影響

由表3可知，在只添加GA3的C1組中，不能誘導(dǎo)出香椿叢芽，當6-BA濃度為0.5 mg·L-1時，誘導(dǎo)出的香椿叢芽數(shù)量多而小，生長緩慢。當培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA，并附加1.0 mg·L-1的GA3時，叢芽增殖倍數(shù)達到4.82，叢芽粗壯，生長旺盛（見圖1C）。隨著6-BA濃度的增加, 叢芽增殖倍數(shù)降低， 并有愈傷產(chǎn)生，不利于后期壯苗培養(yǎng)。因此，適合香椿叢芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為：MS＋1.0 mg·L-16-BA＋0.1 mg·L-1NAA＋1.0 mg·L-1GA3（C5組）。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對香椿試管苗壯苗培養(yǎng)的影響

由于叢芽誘導(dǎo)的無菌苗較瘦弱, 進行壯苗培養(yǎng)有利于得到健壯芽苗。由表4可知，只添加2.0 mg·L-1GA3的D1組可以促進芽苗生長，但芽苗細弱，添加6-BA和IAA后，芽苗基部都有膨大現(xiàn)象（D2～D7組）。當6-BA濃度一定時，隨著IAA濃度的增加，苗高有所降低，當IAA濃度達到0.5 mg·L-1時有愈傷產(chǎn)生。當6-BA為1.0 mg·L-1時，芽苗有增殖現(xiàn)象發(fā)生，不利于壯苗培養(yǎng)。因此，香椿無根苗壯苗的最佳培養(yǎng)基為：MS＋0.5 mg·L-16-BA＋0.05 mg·L-1IAA＋2.0 mg·L-1GA3（D2組）。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對叢生芽誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of plant growth regulators on the induction of cluster buds

表4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對香椿試管苗壯苗培養(yǎng)的影響Table 4 Effects of different plant growth regulators on seedling culture of Toona sinensis

2.5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對生根的影響

由表5可知，當培養(yǎng)基中（E1組）沒有添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑，芽苗的生根率和生根條數(shù)都為0。當培養(yǎng)基中只添加IBA時，隨著IBA濃度的增加，生根率和平均生根條數(shù)增大，當IBA濃度為2.0 mg·L-1時，10 d后有白色根系產(chǎn)生，45 d后生根效果最佳，生根率為78.16%，平均生根條數(shù)為4.8，根系發(fā)達（見圖1F、1G）。當培養(yǎng)基中加入2.0 mg·L-1IBA時，隨著NAA濃度增加生根率逐漸下降，并且根系分化不明顯，芽苗基部產(chǎn)生愈傷并有玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生，不利于后期煉苗移栽（見圖1H）。因此，MS＋IBA 2.0 mg·L-1為生根的最適培養(yǎng)基（E5組）。將生根45 d的試管苗打開瓶蓋在人工氣候室中煉苗2 d，保持其濕度為65%左右。去掉根部的培養(yǎng)基， 然后移栽到園土∶草炭土∶珍珠巖體積比為2∶2∶1的混合基質(zhì)中，移栽初期保持盆內(nèi)微環(huán)境相對濕度為75%～85%。30 d后統(tǒng)計移栽成活率達到77.5%（見圖1I）。

表5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對生根的影響Table 5 Effects of plant growth regulators on the percentage of rooting

3 結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)中，菌類污染是實驗成功與否的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)不同種子選擇合適的消毒材料、消毒時間是降低組織培養(yǎng)中外植體菌類污染和快速、高效地獲得無菌材料的關(guān)鍵步驟，常用的消毒劑有：酒精，溴水，次氯酸鈉，過氧化氫，升汞，抗生素和高錳酸鉀等，其中升汞被認為是目前消毒效果最好的。本試驗在對香椿種子滅菌處理時發(fā)現(xiàn)3種材料都有滅菌的作用。雖然升汞對香椿種子滅菌效果最好，但種子萌發(fā)效果明顯低于次氯酸鈉和雙氧水，這與江濤等[7]在毛竹種子組培滅菌試驗中研究結(jié)果一致。培養(yǎng)基對植物組織培養(yǎng)有一定的影響，1/2MS培養(yǎng)基是油桐種胚再生體系建立的較佳培養(yǎng)基[8]。WPM培養(yǎng)基是最適合美國流蘇離體胚萌發(fā)啟動的基本培養(yǎng)基[9]。吳俊長等[10]發(fā)現(xiàn)將珙桐種胚接種于WPM培養(yǎng)基上，外表面2 d后形成少許致密氧化物，些許褐化，后期生長快速。本試驗中，1/2MS和WPM培養(yǎng)基對香椿種子的成苗率影響差異不大，但都顯著高于MS培養(yǎng)基，可能原因是MS培養(yǎng)基中無機鹽含量高影響種子的萌發(fā)。

增殖倍數(shù)的高低反映了植物快速繁殖的速度和效率，是工廠化育苗時預(yù)估苗木生產(chǎn)總量的重要指標，在叢生芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)中，6-BA的使用比較常見，但常與其他植物生長調(diào)節(jié)劑一起使用[11]。本試驗中，隨著培養(yǎng)基中添加6-BA濃度的升高，香椿芽苗的增殖倍數(shù)呈先增大后減小的趨勢，與大花型紅花蝴蝶蘭組培增殖結(jié)果一致[12]；隨著NAA濃度的增加，芽膨大變形成為綠色半透明的畸形苗，基部出現(xiàn)愈傷并有玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生，與百合科巴迪亞壽組培增殖結(jié)果一致[13]。有學(xué)者研究表明，增殖倍數(shù)過高會引起組培苗的弱化, 生長勢變差[14]。本試驗中當6-BA濃度為0.5 mg·L-1時，增殖倍數(shù)顯著高于6-BA濃度為2.0 mg·L-1，但叢芽小，生長緩慢。

由于叢芽誘導(dǎo)的無菌苗較瘦弱，在培養(yǎng)中添加細胞分裂素和生長素進行壯苗，有利于得到健壯芽苗。已有學(xué)者進行大量研究，迷人杜鵑在0.5 mol·L-12-ip＋0.1 mol·L-1NAA 的培養(yǎng)基上壯苗效果最佳[15]。堇葉紫金牛的最佳壯苗培養(yǎng)基為1.0 mg·L-1KT＋0.5 mg·L-1NAA[16]。本試驗結(jié)果表明：當培養(yǎng)基中添加較低濃度的6-BA（0.5 mg·L-1）時，IAA濃度降低更有利于壯苗培養(yǎng)，可能原因是隨著培養(yǎng)時間的延長，芽苗體內(nèi)的激素在逐漸升高，過高的激素對芽苗的生長有抑制作用[17-18]；高濃度的生長素和細胞分裂素組合會使芽苗增高效果減弱并有愈傷產(chǎn)生，這與田奧磊等在武夷巖茶壯苗生長培養(yǎng)試驗中研究結(jié)果一致[19]。在進行生根誘導(dǎo)培養(yǎng)時，IBA和NAA是最廣泛應(yīng)用的植物生長調(diào)節(jié)劑。本試驗結(jié)果表明：培養(yǎng)基中添加IBA的濃度越高，生根率越高，芽苗根系生長情況越好，這與陳珂在紅椿生根培養(yǎng)試驗中結(jié)果一致[20]。當IBA濃度為2.0 mg·L-1時，隨著NAA激素濃度的提高，生根率降低，根部愈傷組織增多，與晏姝等在南洋楹和郭樹義等在烏腺金絲桃組培生根試驗中研究結(jié)果一致[21-22]。

目前，香椿組織培養(yǎng)常以葉片、帶芽莖段為起始外植體，許麗瓊等[5,23]以葉片為起始外植體誘導(dǎo)香椿組培苗時發(fā)現(xiàn)，獲得無菌葉片時容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。梁明勤等[24]以帶芽莖段為起始外植體發(fā)現(xiàn)，在生根培養(yǎng)時添加1 g·L-1AC 的處理不僅生根率高，而且芽苗粗壯。馬勤[25]研究發(fā)現(xiàn)以帶芽莖段為起始外植體進行組織培養(yǎng)時受到取材的限制，其中以6月中旬—7月下旬的當年生半木質(zhì)化的非休眠期腋芽莖段為最佳。本研究以種子獲得無菌苗為起始外植體建立香椿的組培快繁技術(shù)體系，可以不受取材時間的限制，并且以種子為起始外植體誘導(dǎo)的香椿無菌苗，其下胚軸和子葉更易誘導(dǎo)出愈傷組織，可為下一步香椿組織培養(yǎng)的間接發(fā)生體系打下基礎(chǔ)。后續(xù)將對葉片和下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織及其誘導(dǎo)分化成芽這一部分內(nèi)容進行研究，為其規(guī)模化生產(chǎn)提供多途徑的技術(shù)依據(jù)。