紅纓海棠嫩枝扦插生根解剖學(xué)觀察

史鋒厚，趙 瑞，羅 帥，沈永寶

（南京林業(yè)大學(xué) a.林學(xué)院；b.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037）

扦插作為林木無(wú)性繁殖的重要方式，已被廣泛應(yīng)用于林木種苗生產(chǎn)。影響插穗生根的因素較多，既包括樹種的遺傳因素和插穗的生理狀態(tài)，又包括扦插環(huán)境。一般插穗的不定根原始體按其形成時(shí)間分為潛伏根原始體和誘生根原始體兩種[1]。林木扦插生根難易和生根時(shí)間因樹種（品種）而異，源于枝條內(nèi)是否存在潛伏根原始體和根原基誘導(dǎo)的難易，一般而言，存在潛伏根原始體的樹木扦插較易生根[2]，誘導(dǎo)根原基發(fā)生部位較多的樹種較易生根[1]。植物激素或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)插穗生根，尤其對(duì)于一些難生根樹種效果明顯，它不僅可以提高生根率、縮短生根時(shí)間，還可以提高生根質(zhì)量，如經(jīng)600 mg/L NAA溶液處理的繡球插穗生根率可達(dá)94%[3]，外施6 000 mg/L K-IBA可顯著提高北美香柏插穗的生根率及生根質(zhì)量[4]，經(jīng)500 mg/L IBA溶液浸泡處理的鉤栗插穗生根率可達(dá)99.7%[5]。植物激素或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)插穗生根的原因由解剖學(xué)分析與其對(duì)根原基的誘導(dǎo)有關(guān)。

紅纓海棠于2017年3月10日被江蘇省林木品種審定委員會(huì)審定為良種，可采用扦插方式繁殖[6]。本文將以紅纓海棠嫩枝插穗作為研究材料，使用NAA對(duì)插穗進(jìn)行促根處理后扦插于全光照自動(dòng)噴霧扦插池中，定期取樣插穗基部制作石蠟切片，觀察插穗根原基誘導(dǎo)發(fā)生部位及不定根發(fā)育過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 嫩枝扦插及管理

2017年7月底，紅纓海棠采穗圃采集半木質(zhì)化枝條制作100根插穗。插穗規(guī)格為長(zhǎng)度15 cm左右，保留2～3個(gè)芽，插穗上部保留2片半葉，上下切口平截。80根插穗基部使用1 000 mg·L-1NAA溶液浸蘸5 s后，按照10 cm×5 cm間距插入以蛭石為基質(zhì)的全光照間歇噴霧扦插池中，扦插深度為插條長(zhǎng)度的1/2；其余20根插穗以清水浸泡作為對(duì)照，插于扦插池中。

扦插池每隔20 min噴霧1次，每次噴15 s，陰天酌量減少噴霧頻次和時(shí)間。扦插后每隔7 d，使用50%多菌靈可濕性粉劑800倍液對(duì)插穗和基質(zhì)噴霧消毒1次。

1.2 取樣、固定、制作切片

扦插后，每隔2 d取樣1次，共取15次；取樣的同時(shí)，對(duì)插穗外部形態(tài)進(jìn)行觀察。每次取3根插穗，將插穗基部1 cm左右切成小段放于盛有70% FAA固定液的玻璃小瓶中固定。樣品固定24 h后，轉(zhuǎn)移至甘油和95%乙醇（體積比為1∶1）混合液中，軟化處理60 d后取出，制作石蠟切片。

參照侯福林[7]的方法，樣品經(jīng)脫水、透明、滲蠟后即可包埋。使用石蠟切片機(jī)切片，切片厚10 μm，用番紅固綠染色，二甲苯透明，中性膠封藏，制成永久切片，用OLYMPUS顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 插穗生根過(guò)程中的外部形態(tài)觀察

扦插4 d后，大多數(shù)插穗下切口處未產(chǎn)生愈傷組織，極少數(shù)插穗切面髓部出現(xiàn)少量愈傷組織突起，呈晶瑩透明狀。扦插8 d后，插穗下切口部位產(chǎn)生腫脹并伴有大量的白色突起。扦插12 d后，部分插穗中下部皮部突起或皮孔出現(xiàn)白點(diǎn)，皮孔開裂，對(duì)照處理插穗仍未產(chǎn)生愈傷組織；此外，部分插穗下切口處木質(zhì)部出現(xiàn)不同程度的腐爛狀況。扦插16 d后，少量對(duì)照插穗產(chǎn)生愈傷組織，大部分NAA處理插穗產(chǎn)生愈傷組織且體積較大；同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)部分插穗未產(chǎn)生不定根也無(wú)愈傷組織，多數(shù)此類型插穗下切口處出現(xiàn)腐爛。扦插18 d后，插穗分生出大量不定根，不定根根長(zhǎng)超過(guò)5 cm，具有高位不定根的插穗基部腐爛較為嚴(yán)重。扦插20 d后，約半數(shù)插穗生根。扦插22 d后，大部分插穗生根且不定根生長(zhǎng)較長(zhǎng)。見圖1。綜合插穗外部形態(tài)觀察，插穗愈傷組織部位和皮部均可產(chǎn)生不定根，其中愈傷組織部位生根較多，判定NAA處理后的紅纓海棠嫩枝扦插生根類型為以愈傷組織生根為主型[6]。

圖1 插穗生根過(guò)程中的外部形態(tài)觀察Fig. 1 The external morphology observation of rooting

2.2 扦插前插穗解剖構(gòu)造

圖2 扦插前插穗解剖構(gòu)造Fig. 2 The anatomical structure of stem before cutting

扦插前插穗橫切面層次分明，由外向內(nèi)依次為表皮、皮層、韌皮部、維管形成層、木質(zhì)部、髓，見圖2。由圖2可知，表皮（E）細(xì)胞為規(guī)則的長(zhǎng)方形細(xì)胞且排列緊密，染色較深。表皮里面是皮層（C），細(xì)胞為不規(guī)則的卵石形，排列較緊密。次生韌皮部（P）主要由韌皮薄壁細(xì)胞、韌皮纖維及篩管組成，與木質(zhì)部相比，其只占很小的部分。維管形成層（VC）由較小且排列緊密的若干層分生細(xì)胞組成。次生木質(zhì)部（X）所占比例較大，主要由導(dǎo)管和木纖維組成，細(xì)胞木質(zhì)化程度較高。插穗的中央部分是髓（PI），原生木質(zhì)部在髓與次生木質(zhì)部之間，其染色相比次生木質(zhì)部較深。髓部細(xì)胞較大，排列疏松，染色較淺。在髓與木質(zhì)部結(jié)合處存在一條染色較深的波浪狀環(huán)帶，其細(xì)胞與髓部細(xì)胞相比，體積小且排列緊湊，為環(huán)髓帶（PZ）。狹窄的髓射線（PR）從環(huán)髓帶擴(kuò)展到韌皮部，細(xì)胞染色較深。通過(guò)石蠟切片觀察，扦插前插穗中不存在根原始體，證實(shí)紅纓海棠枝條內(nèi)不存在潛伏根原基。

2.3 不定根誘導(dǎo)發(fā)生的部位及發(fā)育過(guò)程

紅纓海棠嫩枝扦插后，可由插穗愈傷組織和皮部長(zhǎng)出不定根，即插穗愈傷組織及皮部均可誘導(dǎo)產(chǎn)生根原基，各處根原基誘導(dǎo)及不定根發(fā)育過(guò)程如下：

2.3.1 愈傷組織內(nèi)分化的根原基

愈傷組織生根是樹木嫩枝扦插生根的主要類型之一，通過(guò)石蠟切片觀察，紅纓海棠嫩枝扦插主要的生根部位就是愈傷組織。

愈傷組織是扦插后插穗基部的形成層恢復(fù)分裂能力后產(chǎn)生的一種組織，由維管形成層發(fā)育而來(lái)，由薄壁細(xì)胞組成[8]。薄壁細(xì)胞個(gè)大、近圓形、排列疏松，細(xì)胞核不明顯。愈傷組織在細(xì)胞數(shù)量不斷增加的同時(shí)其內(nèi)部的一些細(xì)胞開始分化，伴隨著細(xì)胞壁的增厚一些細(xì)胞分化成輸導(dǎo)組織。愈傷組織內(nèi)的輸導(dǎo)組織一部分是插穗基部維管形成層分裂分化的延續(xù)（圖3A），另一部分獨(dú)立形成于愈傷組織內(nèi)部（圖3C）。

紅纓海棠愈傷組織中可分化形成木質(zhì)部和形成層。在木質(zhì)部外側(cè)，有些細(xì)胞特化形成具有根原始體特征的細(xì)胞，與周圍的愈傷薄壁細(xì)胞有明顯的界限（圖3B），在其發(fā)展過(guò)程中，由近圓形的細(xì)胞團(tuán)變成先端較尖的誘發(fā)根原基。這些根原基細(xì)胞繼續(xù)伸長(zhǎng)，突破愈傷組織表面伸出體外。伴隨著根原基及不定根的發(fā)育，不定根內(nèi)部維管系統(tǒng)同時(shí)發(fā)育，最終與插穗內(nèi)的維管系統(tǒng)相連。扦插后16 d，由愈傷組織形成的不定根伸出插穗。

2.3.2 髓射線與皮層交界處薄壁細(xì)胞分化形成根原基

圖3 愈傷組織內(nèi)分化的根原基解剖結(jié)構(gòu)Fig. 3 The anatomical structure of root primordium in the callus

紅纓海棠插穗內(nèi)部髓射線與皮層交界處存在一團(tuán)分裂能力較強(qiáng)的細(xì)胞，該團(tuán)細(xì)胞與周圍的皮層薄壁細(xì)胞明顯不同，細(xì)胞體積小、排列緊密、細(xì)胞質(zhì)濃，染色較深（圖4A）。這團(tuán)細(xì)胞繼續(xù)分裂分化可誘導(dǎo)成根原基，扦插12 d后，根原基發(fā)育成排列緊密的圓球狀細(xì)胞（圖4B）。扦插16 d后，圓球狀的根原基繼續(xù)發(fā)育，一端伸長(zhǎng)，形似蝌蚪狀（圖4C）。髓射線與皮層交界處形成的根原基較多地發(fā)生于皮孔附近，由此處根原基發(fā)育形成的不定根可以較容易地由皮孔穿出；若形成根原基的部位不處于皮孔附近，不定根將突破皮層伸出體外，突破皮層時(shí)，根原基已發(fā)育成具有根冠、分生區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)等較為完整的根尖組織（圖4D）。這種根原基的發(fā)生、發(fā)育與愈傷組織的出現(xiàn)及發(fā)育幾乎同時(shí)進(jìn)行，所形成的不定根約在扦插后16～18 d伸出插穗。

圖4 髓射線與皮層交界處根原基的解剖構(gòu)造Fig. 4 The differentiation of root primordium

2.3.3 維管形成層分化形成根原基

紅纓海棠插穗維管形成層具有較強(qiáng)的分裂能力，扦插后約10 d，維管形成層便恢復(fù)強(qiáng)烈的分裂能力，次生木質(zhì)部與韌皮部間有5～6層分生細(xì)胞，形成層帶明顯加寬，細(xì)胞分裂分化更加活躍，向內(nèi)向外分裂出大量的薄壁細(xì)胞。在髓射線與維管形成層交界處的薄壁細(xì)胞具有很強(qiáng)的分裂能力，形成根原基，這些細(xì)胞不斷分裂并伸向皮層，最終發(fā)育成不定根伸出插穗（圖5A、5B）。在突破表皮之前，整個(gè)不定根呈圓錐狀，其根冠較為發(fā)達(dá)，既起到保護(hù)分生區(qū)的作用，又有利于突破表皮（圖5C）。由維管形成層處形成的根原基至不定根突破表皮的時(shí)間不超過(guò)20 d。

圖5 維管形成層根原基的解剖結(jié)構(gòu)Fig. 5 The anatomical structure of root primordium induced by vascular cambium

2.3.4 髓射線與環(huán)髓帶交界處形成根原基

圖6 髓射線與環(huán)髓帶交界處誘發(fā)根原基Fig. 6 The root primordium induced between vascular rays and perimeter

枝條髓射線起源于環(huán)髓帶，環(huán)髓帶細(xì)胞較小、排列緊密、染色較深，細(xì)胞非常活躍。髓射線端部連接著環(huán)髓帶，沿著環(huán)髓帶呈發(fā)射狀排列。紅纓海棠插穗扦插后，與髓射線交界處的環(huán)髓帶逐漸加寬（圖6A），其細(xì)胞較小，排列整齊緊湊，細(xì)胞分裂形成規(guī)則的帶狀并向木質(zhì)部延伸。此處細(xì)胞分裂延伸至與髓射線的交界處，髓射線加寬（圖6B），形成根原基，此過(guò)程僅需8 d。插穗內(nèi)根原基逐步發(fā)育成不定根，穿過(guò)維管形成層、韌皮部和皮層，最后突破表皮，此過(guò)程約需12 d。

3 討論與結(jié)論

3.1 插穗根原始體類型

插穗形成的不定根是由根原始體發(fā)育而來(lái)的，分為潛伏根原始體或誘發(fā)根原始體[1]，有些樹種扦插不定根可產(chǎn)生于兩種根原始體，如桑樹[9]，有些樹木則只存在一種根原始體，如棱角山礬[10]、歐李[11]和華北五角楓[12]插穗均只有誘生根原始體。針對(duì)蘋果屬植物扦插研究報(bào)道較多，但涉及扦插不定根發(fā)生解剖學(xué)的研究較少，對(duì)于插穗中是否存在潛伏根原始體未開展論證。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紅纓海棠扦插前枝條內(nèi)不存在潛伏根原始體，其扦插生根屬于誘導(dǎo)生根型，這與許曉崗對(duì)垂絲海棠、海棠果、楸子的研究結(jié)論相符合[8,13-14]。

3.2 插穗誘發(fā)根原基發(fā)生部位

插穗扦插后分化形成的根原始體被稱為誘發(fā)根原始體，它可以由維管形成層、韌皮薄壁組織細(xì)胞、韌皮射線、髓射線及其復(fù)合組織等部位產(chǎn)生，也可在愈傷組織中產(chǎn)生[2]。扦插繁殖過(guò)程中，不同樹種誘發(fā)根原始體產(chǎn)生的部位不同，或來(lái)源于單一部位或來(lái)源于多個(gè)部位，如歐李插穗不定根原基起源于髓射線[11]、棱角山礬插穗根原基是由髓射線與形成層交接處的細(xì)胞分化而成[10]、華北五角楓不定根根原基起源于愈傷組織[12]、歐美雜種山楊[15]和柚木[16]不定根根原基起源于維管形成層，沙棘扦插根原基起源于維管形成層細(xì)胞處和韌皮部薄壁細(xì)胞區(qū)域[17]，油茶誘生根源于形成層、韌皮部及愈傷組織等部位[18]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紅纓海棠嫩枝插穗誘生根原基可產(chǎn)生于愈傷組織、髓射線與皮層交界處薄壁細(xì)胞、維管形成層、髓射線與環(huán)髓帶交界處等4個(gè)部位，以往文獻(xiàn)報(bào)道同屬的垂絲海棠插穗誘生根原基形成于愈傷組織[8]，而海棠果插穗愈傷組織內(nèi)卻未發(fā)現(xiàn)根原基，其誘生根原基由初生射線與維管形成層交匯處細(xì)胞的分裂分化形成[13]。如此親緣關(guān)系較近的樹種，插穗誘發(fā)根原基產(chǎn)生部位卻存在很大差異，分析該問(wèn)題的原因可能源于三個(gè)方面：其一，樹種（品種）間誘發(fā)根原基產(chǎn)生部位存在很大差異，可能由樹種的遺傳特性所決定，如蒙椴誘生根原基源自髓射線與皮層交界處、愈傷組織、維管形成層，屬于較易生根樹種，而糠椴誘生根原基源自愈傷組織、維管形成層，屬較難生根樹種[19]。其二，扦插處理方法不同導(dǎo)致誘發(fā)根原基產(chǎn)生部位存在差異，加溫處理的四倍體刺槐硬枝插穗根原基產(chǎn)生于髓射線與皮層交界處薄壁細(xì)胞和愈傷組織2個(gè)部位，不加溫處理的硬枝插穗根原基則僅產(chǎn)生于愈傷組織[20]；采用立體育苗的桑樹插穗誘發(fā)根原基由維管形成層的薄壁細(xì)胞發(fā)育形成，而常規(guī)綠枝插穗誘發(fā)根原基卻源自愈傷組織[9]；筆者也曾證實(shí)IBA和NAA溶液均可促進(jìn)紅纓海棠插穗愈傷組織生根，NAA處理插穗還可促進(jìn)插穗皮部生根[6]。其三，扦插穗條木質(zhì)化程度不同，誘發(fā)根原基產(chǎn)生部位存在差異，四倍體刺槐硬枝插穗根原基產(chǎn)生于髓射線與皮層交界處薄壁細(xì)胞和愈傷組織2個(gè)部位，嫩枝插穗根原基產(chǎn)生于愈傷組織[20]；中國(guó)沙棘木質(zhì)化枝條根原基起源于木質(zhì)部中的木射線細(xì)胞，而半木質(zhì)化枝條根原基則發(fā)生于韌皮薄壁細(xì)胞與形成層之間[21]。

3.3 扦插生根的難易與生根類型之間的關(guān)系

插穗中若存在潛伏根原始體，扦插容易生根，扦插后需誘發(fā)根原始體的插穗則不容易生根[2]。筆者前期已經(jīng)證實(shí)紅纓海棠扦插屬于較難生根樹種，不使用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理的插穗生根率不足10%，且無(wú)皮部生根；使用IBA和NAA處理插穗后可以促進(jìn)插穗生根，且生根多屬于愈傷組織生根型，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示NAA處理有利于誘導(dǎo)插穗皮部生根[6]。同時(shí)，扦插生根的難度還與誘發(fā)根原始體部位的數(shù)量有關(guān)，若插穗中誘發(fā)根原基的部位較少，則不宜誘導(dǎo)生根，如歐美雜種山楊由于扦插不定根根原基起源單一導(dǎo)致扦插難生根[15]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，誘發(fā)根原始體發(fā)生部位較多有利于生根，經(jīng)NAA處理的紅纓海棠嫩枝扦插不定根根原基來(lái)自于愈傷組織等4個(gè)部位，生根率接近70%[6]，這與油茶扦插具有相似之處，其根原基可產(chǎn)生于形成層、韌皮部及愈傷組織等部位，生產(chǎn)實(shí)踐證實(shí)油茶屬于較易生根樹種[18]。凡屬難生根的樹種，插條的不定根絕大多數(shù)是愈傷部位生根[22]。插穗是否形成愈傷組織與插穗生根難易因樹種而不同，柚木嫩枝扦插所形成的愈傷組織與生根呈負(fù)相關(guān)[16]，油茶不定根的發(fā)生與愈傷組織沒(méi)有直接關(guān)系[18]，華北五角楓[12]不定根根原基則僅來(lái)源于愈傷組織。本實(shí)驗(yàn)及前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，使用NAA和IBA處理插穗后，有利于誘導(dǎo)形成愈傷組織，且促進(jìn)了愈傷組織生根，對(duì)于紅纓海棠而言愈傷組織形成有利于扦插生根。

本研究以1 000 mg·L-1NAA溶液對(duì)嫩枝插穗進(jìn)行促根處理，于扦插過(guò)程中取樣制作石蠟切片，證實(shí)紅纓海棠嫩枝扦插生根屬于誘導(dǎo)生根型，誘生根原基可產(chǎn)生于愈傷組織等4個(gè)部位。本實(shí)驗(yàn)僅選用NAA單一濃度促根生根劑，未對(duì)NAA其他濃度生根劑和IBA等其他種類生根劑開展對(duì)比研究，其他生根劑對(duì)于插穗根原基的誘導(dǎo)作用及誘生根原基產(chǎn)生部位有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每次取樣的穗條僅為3根，制作石蠟切片的數(shù)量也較為有限，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將加大取樣數(shù)量和切片制作數(shù)量，以驗(yàn)證誘導(dǎo)根原基是否還有其他產(chǎn)生部位。