埃及研究奶牛隱性乳房炎預警新指標MAA

文│伍佰鑫 何芳 浣成 段洪峰（湖南省畜牧獸醫研究所）

朱彥群 張永紅（湖南金健乳業有限責任公司）

乳房炎是由幾種細菌及其毒素引起的乳腺炎癥，是奶牛最常見的疾病之一。患畜產奶量減少、牛奶質量改變，未到使用年限就不得不被淘汰，給奶牛養殖者造成了重大的經濟損失。隱性乳房炎會負面影響到牛奶質量（牛奶中含有炎癥要素和細菌）；減少的奶量會占到總損失奶量的2/3；患畜會成為其他奶牛感染隱性乳房炎的傳染源。目前，主要通過體細胞數（SCC）分析的方式篩查乳房內感染，健康奶牛乳中SCC較少；如果SCC（大量）增加，就暗示有隱性乳房炎。但是，SCC受很多因素影響，如年齡、泌乳天數、季節、應激、飼養管理和日復一日的變化。因此，SCC并不總是與乳房感染有關。

病原微生物進入乳池就開始增殖，誘導先天性免疫系統抵抗入侵者，伴隨牛奶中的SCC和乳頭管上皮細胞數增加，接著是細胞因子（小分子多肽）的合成上調。這些細胞因子誘導血管內皮黏附分子表達，促進中性粒細胞（體細胞）跨內皮細胞向感染部位遷移。其中一些細胞因子誘導急性期反應，表現為發燒、白細胞動員、促進急性期蛋白質（APP）的產生。

反芻動物主要的APPs是血清淀粉樣蛋白A（SAA）和結合珠蛋白（Hp）。機體組織損傷后（24小時），血漿和（或）其他體液中的SAA濃度迅速而強烈地增加（1000倍），使得這種蛋白作為非特異性的炎癥標記物具有潛在的應用價值。牛奶中的這種蛋白水平是奶牛乳房炎感染的敏感指標。

埃及的哈尼·艾哈邁德·侯賽因（Hany Ahmed Hussein）等學者，通過對68頭（每頭4個乳區）處于泌乳中期的奶牛采集272份奶樣、檢測奶樣中的SCC和MAA（乳淀粉樣蛋白A）濃度、分離培養出344個細菌菌株，發現了引起乳房炎的主要病原體，即鏈球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌。同時，比較了SCC與MAA檢測結果的相關性。

一、研究方法

對68頭（每頭4個乳區）處于泌乳中期的黑白花奶牛，采集272份奶樣，每份奶樣15毫升。采樣前，用濃度為70%的酒精消毒乳頭，前3次擠出的奶不采集。采樣后，將樣本裝入消毒管，置于冰塊上，轉移至實驗室，24小時內進行SCC和細菌檢測。奶樣在-18℃條件下保存，直至MAA分析結束。272份奶樣中，220份（80.88%）來自臨床診斷為健康的奶牛；52份（19.12%）來自臨床診斷為有乳房炎癥狀的奶牛：擠奶有痛感、乳房腫脹、產奶量減少、牛奶質量明顯改變（微黃色、有塊狀物）。

運用基于熒光圖像分析技術的NucleoCounter體細胞檢測儀檢測奶樣中的SCC，測定范圍為1萬～200萬個細胞/毫升。所有奶樣都取10微升樣品，37℃培養于血瓊脂基質、麥康基瓊脂、馬-欣二氏瓊脂（波蘭）和愛德華茲培養基（英國），分別培養24小時和48小時。通過革蘭氏染色記錄菌落形態，運用API檢驗（波蘭）對分離的細菌進行詳細鑒定。

根據SCC和細菌檢測，將奶樣分為7個組：G1-菌檢（-）、SCC≤50萬個細胞/毫升；G2-菌檢（-）、SCC＞50萬個細胞/毫升；G3-菌檢（+）、SCC≤20萬個細胞/毫升；G4-菌檢（+）、20萬個細胞/毫升＜SCC＜50萬個細胞/毫升；G5-菌檢（+）、50萬個細胞/毫升＜SCC≤100萬個細胞/毫升；G6-菌檢（+）、100萬個細胞/毫升＜SCC≤200萬個細胞/毫升；G7-菌檢（+）、SCC＞200萬個細胞/毫升。運用酶聯免疫吸附測定套件（ELISA，愛爾蘭）并根據說明書，測定上述5個陽性組奶樣的MAA濃度。主要測定過程是將牛奶和生物素化單克隆SAA抗體培養在微滴板孔內，牛奶中的MAA被黏結成像三明治的標記物；沖洗移除未黏結物之后，在酶底物（四甲基聯苯胺）加入之前，將剩余物和鏈霉親和素-過氧化物酶一起培養在微滴板孔內；加入酶底物之后停止反應。運用自動平板閱讀器（美國），在450納米處測定微滴板孔內的光密度；通過繪制MAA濃度與光密度的關系曲線，確定樣品中未知的MAA濃度。樣品先按1∶50稀釋，然后一式兩份載入。

二、研究結果

272份奶樣中，68份（25%）菌檢為陰性、204份（75%）菌檢為陽性。204份中，96份只受單一病原體感染，占總奶樣數（272份）的35.3%；108份受多種病原體感染，占總奶樣數（272份）的39.7%。從272份奶樣中分離出344個細菌菌株，其中，鏈球菌132個（占總奶樣數的48.53%）、大腸桿菌100個（占總奶樣數的36.76%）、金黃色葡萄球菌80個（占總奶樣數的29.41%）、凝固酶陰性葡萄球菌32個（占總奶樣數的11.76%）。

有乳房炎臨床癥狀奶牛的52份奶樣中，40份（76.92%）菌檢為陽性、12份（23.08%）菌檢為陰性。沒有乳房炎臨床癥狀奶牛的220份奶樣中，148份（67.27%）的SCC≤50萬個細胞/毫升，但其中100份菌檢為陽性，可能是感染初期，中性粒細胞還沒有完全在感染部位云集；其余的72份（占32.73%）SCC＞50萬個細胞/毫升，但其中8份菌檢為陰性，可能有其他病原體（霉菌或支原體）感染而沒有被檢測出來。

7個組奶樣（G1～G7）的MAA濃度分別是3.58毫克/升、35.20毫克/升、13.01毫克/升、28.07毫克/升、31.23毫克/升、39.35毫克/升、37.22毫克/升，MAA與SCC有很強的相關性。特別是G3組（SCC≤20萬個細胞/毫升、菌檢為陽性）的MAA約是G1組（SCC≤50萬個細胞/毫升、菌檢為陰性）MAA的4倍，表明受細菌感染后，MAA有顯著變化。相對于隱性乳房炎的其他診斷指標來說，MAA的優勢是：健康動物乳中MAA的含量極少，無法被檢測到；除乳房炎外，MAA不受其他因素影響，能在保存的樣品中被檢測到。因此，牛奶中的MAA濃度是比檢測SCC更有用的診斷指標，可監控奶牛的乳房健康。

三、啟迪和討論

有乳房炎臨床癥狀奶牛的52份奶樣中，40份（76.92%）菌檢為陽性、12份（23.08%）菌檢為陰性；說明臨床診斷有乳房炎的多數（76.92%）確實有乳房炎，少數（23.08%）實際上沒有乳房炎，也就是說，根據表面現象診斷并不是100%準確。這52份奶樣占總奶樣數（272份）的19.12%，再根據總奶樣數中有204份（75%）菌檢為陽性，可判斷出臨床診斷不出的隱性乳房炎占55.88%（=75%-19.12%）；也就是說，半數以上的乳區看起來健康，實際上是亞健康。

沒有乳房炎臨床癥狀奶牛的220份奶樣中，148份（67.27%）的SCC≤50萬個細胞/毫升，據此判斷無隱性乳房炎；實際上只有54.55%{=（220-100）÷220}的奶樣菌檢為陰性（的確無隱性乳房炎），說明單純依靠SCC判斷無隱性乳房炎的誤差是12.72%（=67.27%-54.55%）。其余72份（32.73%）的SCC＞50萬個細胞/毫升，據此判斷有隱性乳房炎；實際上只有29.09%{=（72-8）÷220}的奶樣有隱性乳房炎，說明單純依靠SCC判斷有隱性乳房炎的誤差是3.64%（=32.73%-29.09%）。由此看來，根據SCC＞50萬個細胞/毫升判斷有隱性乳房炎的準確度（誤差小），高于根據SCC≤50萬個細胞/毫升判斷無隱性乳房炎的準確度（誤差大）。

用MAA檢測隱性乳房炎奶樣很可能更加準確，但檢測過程復雜，亮點是展示了在奶樣上做文章的創新思維。目前，國內主要根據SCC預警隱性乳房炎奶樣（奶牛），多數運用丹麥福斯集團公司FossomaticTM FC體細胞儀，檢測過程方便快捷。但一般情況下，如果沒有額外進行菌檢和細菌培養，則不能肯定地說SCC為多少時就一定（沒）有隱性乳房炎。

總而言之，在生鮮牛奶的生產上，需要快速而準確地識別出有隱性乳房炎的奶牛并及早防治，減少經濟損失，保證牛奶質量。因此，國內儀器設備生產廠家應結合MAA、SCC和菌檢研制出“中國制造”的隱性乳房炎檢測儀器，在21世紀人工智能時代，助力中國科技走在世界前列。