水稻銨轉運蛋白基因OsAMT1;2的啟動子分析①

李素梅，施衛明

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水稻銨轉運蛋白基因的啟動子分析①

李素梅1，施衛明2*

(1江蘇省中國科學院植物研究所，南京 210014；2土壤與農業可持續發展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008)

AMT是介導植物銨態氮高親和吸收的跨膜蛋白，已報道編碼AMT蛋白的大部分基因的表達依賴外界氮水平和環境的調控，但調控的機制目前尚不清楚。水稻的基因在氮缺乏條件下強烈誘導表達，因此，本研究從水稻基因組DNA中PCR克隆基因上游1 940 bp的啟動子序列，采用軟件和試驗分析啟動子存在的順式調控元件與外界氮調控的相關性。軟件預測結果表明，啟動子區域內除含有TATA-box和CAAT-box外，同時含有多種非生物脅迫、生物脅迫、激素響應和光響應相關的順式作用元件，如Box-w1、MBS、MeJA、TATC和ERE應答元件。將啟動子的5′端順序刪除獲得5個不同缺失片段分別與GUS報告基因融合構成表達載體，通過農桿菌介導轉入水稻成熟胚誘導的愈傷組織中獲得轉基因水稻，T1代植株水平上的GUS活性分析表明，最短啟動子片段(–211 bp)能夠啟動GUS表達，但是GUS活性較低，對缺氮效應也不顯著；中等長度啟動子片段(–763 bp)的GUS活性提高，受缺氮誘導顯著，且缺氮誘導不再隨啟動子長度增加而顯著增強，說明應答氮響應的順式作用元件位于–211 bp和–763 bp之間，非生物脅迫和激素相關的順式作用元件多在這個區域內，是否與氮的調控存在相關性有待后續進一步證明。

銨轉運蛋白AMT；啟動子；順式作用元件；GUS組織化學染色

一般說來在低溫、淹漬及酸性土壤中，由于硝化作用被抑制，銨態氮成為植物的主要氮源。水稻是喜歡銨態氮的植物之一。植物根中銨態氮的高親和吸收系統由跨膜蛋白AMT介導。擬南芥 AtAMT1;1是首個從植物中分離的銨轉運蛋白[1]，截至目前已經從擬南芥、水稻()、番茄()、百脈根()、油菜()、山楊(subsp.)、苜蓿()、綠藻()、小麥()、大豆()、高粱()等植物中分離到AMT蛋白，表明AMT蛋白廣泛分布在單子葉和雙子葉植物中，但是不同的植物中AMT蛋白基因數目不同。水稻中至少存在12個AMT蛋白[2-3]，被分成5個不等數量的基因家族，的表達調控已經有很多研究報道[4-5]，其中AMT1家族的3個基因的研究最為深入，包括異源體系的生物功能驗證和基因的表達特征和調控。

早期的生理試驗發現擬南芥根對銨態氮的吸收量與光照相關，到暗周期突然下降，而且吸收量與根中AMT的轉錄水平相關[6]，暗周期期間補給蔗糖可提高AMT基因的轉錄水平[7]，說明光周期影響AMT的表達。的表達也受到光周期的影響[8]，同時在根部和地上部均有表達，但各自具有特異的組織表達特征，并專一性的受氮水平調控。(AF289477)是水稻AMT1家族中表達水平最高的基因，根中地上部均有同等表達，受低氮誘導表達[9]；(AF289478)主要在根部表達，且低氮水平能強烈誘導其表達[5,10]；(AF289479)主要在根中表達，低氮抑制其表達。研究也發現不僅受氮水平調控，隨著幼苗的生長，它的表達水平也迅速提高以適應水稻的生長[10]。然而，AMT基因的表達調控機制尚不清楚。啟動子是調控基因表達的重要順式作用元件，在基因表達過程中起著重要作用，而受氮水平的表達調控比較顯著。因此本研究從軟件預測和啟動子對報告基因GUS活性兩方面研究啟動子的順式作用元件與氮調控的應答區域之間存在的可能關系，以期探索對水稻銨態氮吸收轉運的順式調控元件，為探明基因的表達調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 OsAMT1;2啟動子區域序列分析

采用Plant CARE (http: //bioinformatics.psb.ugent. be/webtools /plantcare /html/)[11]對啟動子順式作用元件進行預測分析。

1.2 水稻受體材料、載體和菌株

以苗期水培條件下氮高效品種桂單4號為啟動子克隆的基因組DNA來源，同時以含有2,4-D的培養基誘導滅菌的桂單4號成熟種子，分取3 ~ 4周培養后分化出的愈傷組織作為后續啟動子融合GUS轉化體系的受體材料。載有基因的pBI121作為表達載體，載體含有的p35S啟動子與啟動子序列進行替換。根癌農桿菌EHA-101介導不同缺失啟動子片段表達載體去轉染誘導出的水稻愈傷組織，進行組織培養獲得不同的轉基因植株。

1.3 OsAMT1;2啟動子克隆和不同長度片段表達載體構建

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲得了所在基因組的序列，選取ATG前1 939 bp作為其啟動子序列。根據啟動子和pBI121載體的序列，利用Primer軟件設計帶有III和HI酶切位點的特異引物P1(ggcagcaag-caggtttagca)和P2(atagccaagtgtggcaaggt)，以水稻桂單4號基因組DNA為模板進行PCR擴增。擴增條件為94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個循環，72℃延伸10 min。PCR產物用10 g/kg瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的片段，連入克隆載體pMD18進行測序。根據軟件預測的順式作用元件所在位置逐一刪除部分啟動子序列獲得不同缺失片段的啟動子，克隆到pBI121中替代p35S，構建不同缺失片段的啟動子融合GUS的表達載體pAMTx。

1.4 轉基因水稻的組織培養和分子檢測

含有不同缺失片段啟動子的表達載體分別轉化農桿菌EHA101，篩選攜帶了表達載體的農桿菌與水稻愈傷組織共培養進行轉染。與農桿菌共培養3 d的愈傷組織用無菌水洗去表面的菌體，在500 mg/L羧芐青霉素的選擇壓力下篩選培養轉化子，分化的獨立的新生T0株系分別用CTAB方法提取葉片中的基因組DNA，以基因組DNA為模板，設計T-DNA插入部分的GUS序列引物，以pBI121 質粒為陽性對照，未轉化的桂單4號為陰性對照，進行PCR檢測。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min， 94℃ 45 s，52℃ 1 min，72℃2 min，30 個循環，72 ℃延伸10 min，預計所有的轉基因植株和對照質粒均能夠擴增出一個1.9 kb 的條帶，擴增后取5 μL產物在10 g/kg的瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。

1.5 T1代轉基因水稻植株不同氮水平的GUS活性組織染色和酶活分析

收獲的不同缺失片段啟動子的T1代水稻種子按照常規方式育種至根長2 cm時移植到尼龍網上，用改良的木村營養液(含0.5 mmol/L NH4NO3作為唯一氮源)進行培養，培養液pH 5.5、加硝化抑制劑二氰胺5.89 mg/L，每3 d更換一次營養液，置于植物生長室培養2周。2周后進行氮水平處理，一半以1 mmol/L NH4+-N為氮源，一半不加氮源，其他條件相同，培養3 d。取0.1 g根系提取可溶性蛋白按Jefferson等[12]的方法測定GUS酶活，同時取啟動子最長片段的轉基因水稻根系進行GUS染色分析。

2 結果與分析

2.1 OsAMT1;2啟動子區域序列分析

起始密碼子ATG上游1.9 kb的序列預測分析結果顯示，啟動子內除含有必需的核心元件CAAT-box和TATA-box外，還包含很多非生物和生物脅迫、激素以及光響應相關的元件(表1)。非生物脅迫相關調控元件包括厭氧誘導的ARE、干旱誘導的MBS和富含TC重復序列的脅迫響應順式作用元件；生物脅迫相關調控元件包括真菌誘導的Box-W1、胚乳表達的GCN4和Skn-1、種子特異性調控的RY-element和生理周期調控的circadian；激素相關的調控元件包括茉莉酸甲酯調控的CGTCA和TGACG、乙烯響應的ERE、赤霉素響應的TATC box和玉米素代謝調節的O2-site；同時還發現了多個參與光響應的元件，G-box、GA、GATA、CATT、GT1、I-box、3-AF1、Box1、Box4、TCT、chs-CMA1a、chs-CMA3a和rbcs-CMA7a。通過對啟動子的序列分析推測其可能是一個脅迫誘導型和光周期調控的啟動子。

2.2 OsAMT1;2啟動子克隆與不同長度序列啟動GUS的表達載體構建

以桂單4號水稻基因組DNA為模板用特異性引物PCR擴增上游1.9 kb的啟動子區域，所獲得序列測序結果與Genbank進行比較分析，同源性達98%，確認是的啟動子序列。結合預測的順式調控元件將1.9 kb按不同長度刪除獲得5個啟動子序列(圖1A)，克隆到表達載體pBI121中替換p35S(圖1B)，以此不同缺失片段的啟動子分析報告基因GUS活性。

表1 水稻OsAMT1;2啟動子區包含的順式調控元件

2.3 表達載體的農桿菌轉化及其驗證

所有的pAMTx結構通過農桿菌EHA101介導轉入誘導的水稻愈傷組織，組培過程中使用潮霉素進行多次篩選獲得陽性愈傷組織，再分化和誘導培養至幼苗長出，取部分幼苗新葉提取基因組DNA進行PCR鑒定(圖2)，含有插入的片段的幼苗移植到土壤中，常規施肥管理至開花結果，收獲T0代種子作為T1的幼苗供GUS活性和酶活分析，每個啟動子結構片段至少保留3株獨立的轉基因株系。

(A：不同長度的OsAMT1;2啟動子序列，包含不同潛在的蛋白轉錄結合基序模塊；B：pAMTx表達載體的T-DNA區結構圖，其中，LB代表左邊界序列，RB代表右邊界序列，Kan代表卡那霉素篩選標記，GUS代表β葡萄糖醛酸酶，35S代表煙草花葉病毒35s啟動子，nos-t代表胭脂氨酸合成酶終止子，x代表不同長度啟動子。)

(圖A中1~6、圖B 中1~7為不同的轉化株系；+ 陽性對照pBI121；–野生型植株基因組DNA)

2.4 轉基因水稻株系的組織化學染色和酶活測定

構建的啟動子表達載體轉化獲得的轉基因株系，在缺氮處理培養下觀察報告基因表達情況。最長啟動子轉基因水稻根系的GUS染色發現在有氮供應時，根系中報告基因在中柱表達，根尖未見表達(圖3A)，經缺氮處理后，報告基因的表達量顯著上調，尤其新生根的根尖表達量迅速提高(圖3B)；縱向壓片和橫切片的結果與整根染色效果相同(圖3C、D)。氮處理下的GUS酶活測定表明最短的啟動子序列(–211 bp)可以啟動GUS的表達，但是GUS活性較低，且受缺氮調控也不顯著，當啟動子長度達到–763 bp長度后啟動的GUS酶活受到缺氮顯著誘導表達，同時發現在763 ~ 1 939 bp范圍內啟動的GUS酶活沒有顯著差異(圖4)，也就是說–763 bp足夠調控下游基因的表達。以上結果表明，啟動子為缺氮誘導的特異型啟動子。在正常條件下，啟動子驅動下游基因集中在根系中柱表達，對銨態氮的吸收貢獻很小；在缺氮條件下，啟動子明顯增強下游基因在皮層和根尖的表達量，從而增強植物對銨態氮的吸收。

(圖A和C為對照，1 mmol/L NH4+-N培養的幼苗根系；圖B和D缺氮處理培養3 d的幼苗根系)

(圖中不同小寫字母表示處理間差異在P<0.05水平顯著)

3 討論

銨態氮是植物重要的氮素營養，過量吸收對細胞有毒害作用[13-14]，因此銨態氮在根內的跨膜運輸必須被精準控制[15-17]，這個過程要求 AMT 的表達及轉運活性在多個層面上被嚴格調控。外部銨態氮的有效性和植株體內氮素營養狀況是影響 AMT 基因表達的主要因素[4,18]，蔗糖、CO2濃度、光周期、菌根共生系統對其 mRNA 水平的轉錄調節也有影響[17]。在轉錄水平調控上，不同家族成員之間的表達調控模式也不盡相同，通過嚴謹的調控網絡有效地調控銨態氮的吸收，以適應外界環境的變化和自身生長的需求。分析發現啟動子的順式作用元件中存在一些非生物和生物調控元件、激素相關以及光響應調控元件(表1)，說明的表達調控可能與啟動子中的這些順式作用元件存在相關性。

氮素缺乏強烈誘導表達量的增加[10]，啟動的GUS 活性再次證明了的缺氮誘導效應(圖4)，且誘導效應自–763 bp 后不再隨啟動子的長度增加有顯著地增加，而非生物脅迫和激素相關的順式作用元件多分布在–211 bp和–763 bp區域內(圖1)，缺氮誘導可能與這些調控元件相關。因為根系適應缺氮或低氮條件會增加根系生物量以擴大吸收面積獲取營養[18]，茉莉酸甲酯調控的CGTCA和 TGACG、乙烯響應的 ERE 和赤霉素響應的 TATC-box 均是誘導細胞分裂生長的順式調控元件，誘導根系加速生長抵抗對環境氮源不足的防御。其次根系的快速增生尋找養分與干旱條件下植物具有更加發達的根系以尋找水分的目的一致，這可能是啟動子分別在–115 bp和–776 bp存在兩個干旱誘導的MBS順式作用元件的原因。AMT受光周期影響的報道很多，早前的研究發現光周期對AMT的調控是通過光合同化產物完成的[4]，氧化磷酸戊糖代謝是糖信號控制AMT表達的可能途徑[20]，最新報道的的表達也受到光周期的調控[9]，這與啟動子中存在多個光響應的順式作用元件相關。此外，菌根共生系統可以影響多種植物中家族基因的表達[21-25]。的啟動子中也存在真菌誘導元件，或許也存在潛在的菌根共生的誘導表達作用。

AMT基因在mRNA水平的表達調控除了與上述因素有關外，還涉及到一些效應因子和轉錄因子，如激酶CIPK23與AtAMT1;1和AtAMT1;2相互作用抑制銨態氮的吸收[26]，轉錄因子OsDOF18誘導AMT的表達調控根系銨態氮吸收[27]。AMT在蛋白水平上也進行有效的調控，擬南芥AtAMT1;3和AtAMT1;1的同源或異源多聚體的活性都受到C末端的調控[28]，AMT蛋白C端磷酸化是AMT變構調節蛋白活性的機制，可以通過磷酸化直接調控AMT/Mep蛋白的轉運活性[29]。

4 結論

通過軟件預測和融合的報告基因GUS活性的結果表明，水稻銨轉運蛋白啟動子區域內除了含有TATA-box和CAAT-box外，同時含有多種非生物脅迫、生物脅迫、激素響應和光響應相關的順式作用元件，如Box-w1、MBS、MeJA、TATC和ERE應答元件。啟動子的不同缺失片段啟動的GUS活性分析指出，–211 bp能夠啟動GUS表達，但是GUS活性較低，對缺氮效應也不顯著，而–763 bp的GUS活性提高，且受缺氮誘導顯著，同時發現自–763開始缺氮誘導不再隨啟動子長度增加而顯著增強，說明應答氮響應的順式作用元件位于–211 bp和–763 bp之間，可能與這個區域內存在的非生物脅迫和激素相關的順式作用元件相關。

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Promoter Analysis of Rice Ammonium Transporters

LI Sumei1, SHI Weiming2*

(1 Institute of Botany, Jiangsu Province and Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210014, China; 2 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China)

AMT is transmembrane protein mediated high-affinity ammonium uptake in plants. It has been reported that the expression of most genes encoding AMT protein depends on external nitrogen level and environmental condition, but the mechanism of expression regulation is unclear. The expression ofwas greatly induced by nitrogen-deficiency. Therefore, the sequence ofpromoter was cloned by using PCR from rice genome DNA and analyzed by using software and experimental analysis fusion GUS reporter gene. Software predicted results showed that the promoter region contained not only the TATA box and CAAT box, but also a variety of cis-elements of abiotic stress, biological stress, hormone and light response, such as Box-w1, MBS, MeJA, TATC and ERE.promoter was deleted along with 5′ end to construct five different pAMT12-x-GUS expression vector, which subsequently were transformed into rice callus to establish different transgenic rice lines. The GUS activity of T1 generation plants showed that the shortest promoter fragment (–211 bp) could start the GUS expression, but GUS activity was low and the effect of nitrogen-deficiency was not significant. The GUS activity and inductive effect of nitrogen-deficiency significantly increased when –763 bp promoter fragment fusion with GUS, additionally the inductive effect no longer significantly enhanced with the increase of the promoter length. The cis-element of abiotic stress and hormones related lies between –211 bp and –763 bp, whether correlation between nitrogen regulation and cis-elements of abiotic stress and hormones remains to be further probed.

Ammonium transporter;promoter; Cis-acting elements; GUS activity

國家自然科學青年基金項目(30800702)資助。

(wmshi@issas.ac.cn)

李素梅(1978—)，女，安徽合肥人，博士，助理研究員，研究方向為氮素吸收轉運機制。E-mail：smli321@163.com

10.13758/j.cnki.tr.2018.03.003

Q786；Q945.12

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