構樹修復對重金屬污染土壤環境質量的影響

曾 鵬,郭朝暉,肖細元,彭 馳,黃 博,辛立慶 (中南大學,冶金與環境學院環境工程研究所,湖南 長沙 410083)

植物修復具有環境友好、成本低、美化環境、不易引起二次污染等優點而被廣泛利用[1].目前植物修復重金屬污染土壤的研究主要集中在東南景天(Sedum alfredii H.)[2]、龍葵(Solanum nigrum L.)[3]等超富集植物和海桐(Pittosporum tobira)[4]、珊瑚樹(Viburnum odoratissinum)[5]、泡桐(Paulownia fortunei)[6]、柳樹(Salix)[7]等耐性植物.木本植物具有生物量大,生長周期長,較大的綠色空間和發達的根系,可廣泛用于重金屬污染土壤的生態復墾[8].然而利用植物修復污染土壤的最終目標不僅是清除或減少土壤中的重金屬等污染物,而且要求恢復污染土壤的生物學特性.有研究表明,重金屬對土壤酶和微生物活性的抑制作用明顯[9-11].但植物可有效降低污染土壤中重金屬對土壤酶活性和微生物的不利影響[12].耐性植物白玉草(Silene vulgaris)可恢復重金屬污染土壤的β-半乳糖苷酶活性,在根際細菌群落中出現了新的物種[13].種植玉米(Zea mays L.)有利于降低 Cd和Pb對土壤脲酶和脫氫酶的抑制作用,并提高土壤基因多態性和基因豐富度[14].因此,植物在修復和改善重金屬污染土壤生態環境質量上扮演重要的角色.

構樹(Broussonetia papyrifera)屬于?？茦媽俚穆淙~喬木,具有速生、適應性強、分布廣、易繁殖等特點,適于重金屬污染礦區生長,是礦區植被恢復的先鋒樹種[15].有研究表明,每株構樹一年可移除Zn和Cu的總量可達 32.5和 6.67mg[16],且構樹對多種重金屬都有較強的富集與轉移能力,其綜合生物濃縮指數可達 2.93[17].總之,構樹在修復重金屬污染土壤方面具有巨大應用前景.然而構樹在修復重金屬污染土壤過程中對污染土壤環境質量的影響還不是很清楚.因此,本文通過溫室盆栽試驗,研究構樹在修復重金屬污染土壤過程中對土壤酶活性和微生物群落結構的影響,以期為構樹大規模生態修復重金屬污染土壤提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 供試土壤和植物

溫室盆栽土壤采自湖南省某典型冶煉區0～20cm的表層土壤,土壤基本理化性質如表1所示.收集的土壤風干過 5mm 篩后用于盆栽試驗.供試植物構樹苗采自野外生長的構樹幼苗.

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 Basic physiochemical properties of tested soil

1.2 實驗設計

將過5mm篩的土壤混合均勻后裝入長33cm,寬22cm,高 19cm 的塑料盆中.每盆裝入土壤 10kg.每盆加入2.7g CO(NH2)2,0.5g NH4H2PO4,1.6g KNO3作為基肥.基肥以70%的田間持水量加入土壤中,平衡30d后,統一移栽大小一致的構樹幼苗.每盆 3次重復.試驗期間,光照周期為10h/d,溫室內晝夜溫度為30/20,℃根據盆栽土壤水分狀況澆灌去離子水,以保持盆栽土壤濕潤.構樹修復和未修復(對照)的土壤在60,90,150,210和270d后進行動態取樣.采取5點取樣法取出適量土壤,一部分用于土壤重金屬有效態含量測定,一部分用于土壤酶活性測定和土壤 DNA的提取.分別動態收獲修復90,150,210和270d后的構樹植株.將每次收獲的構樹植株按根、莖、葉分開,依次用自來水和去離子水清洗干凈后,105℃殺青30min后,在60℃下烘干至恒重,稱重,粉碎備用.

1.3 測試與分析

土壤基本性質的分析根據魯如坤[18]的方法:土壤pH值采用Mettler Toledo 420 pH計測定(水土比為2.5:1);土壤有機質含量采用低溫外熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定;土壤堿解氮、有效磷和速效鉀分別采用堿解擴散-硫酸滴定法、碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法和乙酸銨提取-原子吸收法測定.植物樣品采用HNO3-HClO4(5:1)消解,土壤樣品采用HNO3-HClO4-HF(5:4:1)消解,土壤中有效態Cd,Pb,Zn和Cu含量采用DTPA浸提(GB/T 23739-2009)[19],土壤有效態As含量采用0.5mol/L NaHCO3浸提[20],消解液和浸提液中Cd,Pb,Zn和Cu含量采用ICP-OES(等離子發射光譜儀,Thermo)測定,As含量采用雙道原子熒光光度計(AFS-2202E,北京海光儀器公司)測定.

土壤酶活性參照關松蔭[21]的方法測定:土壤脫氫酶活性測定采用紅四氮唑(TTC)比色法,脫氫酶活性單位為37℃下,24h內土壤中三苯基甲臜(TPF) μg/g;土壤脲酶活性測定采用靛酚藍比色法測定,脲酶活性單位為37℃下,24h內土壤內NH4+-N μg/g;土壤蔗糖酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定,以37℃下培養24h內土壤中葡萄糖(glucose)mg/g;土壤酸性磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法,酸性磷酸酶活性單位為37℃下,3h內土壤內中酚(phenol)μg/g.

土壤DNA提取以及PCR-DGGE分析:土壤DNA提取根據土壤DNA提取試劑盒(Omega Bio-tek,US)說明書操作,-20℃保存.土壤DNA 16S和18S rDNA PCR擴增程序分別參見Xiao等[22]和Xu等[23]的方法.然后取16S或18S PCR擴增產物15μL,在聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(100%的變性劑為7mol/L尿素和40%的去離子甲酰胺),變性劑梯度范圍 45%～70%(細菌)或30%～50%(叢枝菌根真菌),60℃下55V電泳14h(細菌)或 12h(叢枝菌根真菌).電泳結束后,采用 EB染色法(0.5μg/L)對凝膠染色 10min,然后用 Gel DOCTMXR+凝膠成像系統進行成像(Bio rad,USA).

1.4 數據分析

所有試驗數據采用Microsoft Excel 2016進行分析處理.采用SPSS 16.0統計軟件進行顯著性檢驗和相關性分析.

構樹體內重金屬富集總量的計算根據如下公式:

式中:T地上部分、T地下部分和 T總和分別表示構樹地上部分、地下部分和整株對某種重金屬的富集總量,mg;C葉、C莖和C根分別表示構樹葉片、莖和根部的某種重金屬含量,mg/kg;B葉、B莖和B根分別表示構樹葉片、莖和根的干重,g.

DGGE圖譜由Quantity One (version 4.6.2)進行分析.香農-維納指數(H)的度算根據式(4):

式中:ni為每個條帶的峰面積,N為所有條帶的總峰面積.均勻度指數(E)的計算公式為:

式中:S為每個泳道的條帶數.采用CANOCO 5.0分析土壤環境因子與微生物群落之間的聯系.

2 結果與討論

2.1 構樹對污染土壤中重金屬的富集特征

構樹對污染土壤中重金屬的富集總量見圖 1.構樹體內As和Pb的富集總量隨修復時間的延長無明顯變化,Cu的富集總量隨修復時間的延長呈現下降的趨勢,原因可能與植物根系長時間與土壤重金屬直接接觸,植物采取一定的保護措施來降低污染土壤中重金屬對植物的毒害有關[24],進而限制植物對污染土壤中As,Pb和Cu的富集.然而構樹對Cd和Zn富集總量隨著修復時間呈現顯著增加的趨勢,且構樹體內對Cd和Zn的最大富集總量為2.26,66.8mg/pot,同時,在修復270d后,地上部分Cd和Zn的富集總量與地下部分相當,分別可達1.17和38.2mg/pot.童方平等[15]研究表明銻礦區重金屬污染地4a生構樹整株可富集1.99mg Cd和67.33mg Zn,與本研究結果相似.但賴發英等[16]表明每株一年生構樹對污染土壤中Zn和Cu移除總量分別為32.51和6.67mg.本研究中構樹對Cu的富集總量一般,原因可能與本研究污染土壤中存在多種重金屬離子,進而導致植物對污染土壤中重金屬離子的選擇性吸收有關[25].研究表明,構樹可有效富集污染土壤中的Cd和Zn,可用于Cd和Zn污染土壤修復與治理.

圖1 構樹對污染土壤中重金屬的富集量隨時間的變化趨勢Fig.1 The total accumulation of heavy metals in B. papyrifera along with cultivation

2.2 構樹生長對污染土壤酶活性的影響

構樹修復重金屬污染土壤過程中土壤脫氫酶、脲酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性隨著修復時間的變化見圖2.構樹修復下,脫氫酶在4種酶活性中對復合污染土壤最為敏感,并隨著修復時間的延長呈顯著下降并趨于平衡,與郭朝暉等[9]和 Liu等[26]的研究表明污染土壤中脫氫酶對重金屬比較敏感,并且植物修復難以恢復其正常酶活性,與本研究結果一致.整個修復期間,與無植物修復的土壤相比,構樹修復下土壤脲酶活性無明顯變化;蔗糖酶活性和酸性磷酸酶活性在修復 90d時達到最大值 6.09mg glucose/(g·d)和192.4μg phenol/(g·3h),脲酶活性在修復 150d 時達到最大值 76.5μg NH4+-N/(g·d),隨后隨時間顯著下降,原因可能與污染土壤中重金屬對土壤酶活性具有一定程度的抑制作用有關[27].然而,構樹修復270d后,土壤蔗糖酶和酸性磷酸酶活性顯著(P＜0.05)提高 3.12倍和 2.29倍.這可能是隨著修復時間的延長,植物根系的生長在一定程度上可緩解重金屬對土壤酶活性的抑制作用.植物修復過程中根系分泌各種有機酸、生長激素等活性物質[28],有利于污染土壤中微生物的生長和活性的提高,從而直接或間接的改善土壤酶活性,與高揚等[14]研究種植玉米可減輕Cd和Pb對土壤磷酸酶和脲酶的影響的結果一致.因此,構樹修復有利于減弱土壤重金屬對土壤酶活性的毒害作用,維持土壤脲酶的正?；钚圆⒏纳仆寥勒崽敲负退嵝粤姿崦富钚?促進污染土壤生物學特性的恢復.

圖2 構樹修復過程中土壤酶活性隨時間的變化趨勢Fig.2 Change of soil enzyme activities along with cultivation under B. papyrifera remediation

2.3 構樹修復下污染土壤中重金屬有效態含量與酶活性的相關性分析

構樹生長下土壤中有效態 As,Cd,Pb,Zn和 Cu含量隨著修復時間呈增加趨勢(表 2).在修復初期(0～150d),土壤中重金屬有效態含量均無顯著變化.修復270d后,土壤中有效態As,Cd,Pb,Zn和Cu含量與未修復的土壤(0d)相比分別提高 56.1%,9.21%,14.2%,19.0%和11.9%.同時土壤pH值隨修復時間呈下降趨勢,且與土壤有效態Cd,Pb,Zn和Cu含量呈負相關,其中與Zn和Cu呈顯著(P＜ 0.05)負相關(表3).由于構樹根系活動旺盛,可分泌大量根際分泌物如草酸、蘋果酸、檸檬酸和富里酸等,可一定程度降低土壤 pH值,使土壤中重金屬有效態含量顯著提高[29].然而,污染土壤中As,Cd,Pb,Zn和Cu有效態含量分別占總量的 0.87%～1.61%,55.34%～64.32%,34.93%～39.98%,24.69%～31.99%和25.15%～32.37%,其中土壤中 Cd,Pb,Zn和 Cu活性和含量都較高,植物修復無法在短時間內有效提取和富集,因此必須輔助物理和化學措施來強化構樹修復重金屬污染土壤.

表2 構樹修復下污染土壤中pH值和重金屬有效態含量的變化Table 2 Changes of pH and heavy metals available contents in contaminated soil with B. papyrifera remediation

從表3可看出,構樹修復下污染土壤中重金屬有效 態含量與脫氫酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性呈負相關,其中土壤脫氫酶與有效態As,Cd,Pb,Zn和Cu含量,蔗糖酶與有效態Cd含量,以及磷酸酶與有效態Cd和Cu含量分別呈顯著負相關(P＜0.05),與Zeng等[30]得出的在植物修復下土壤中有效態 Cd與土壤脫氫酶和脲酶呈顯著負相關的研究結果類似.重金屬對污染土壤酶活性的抑制主要表現為:①對土壤微生物的毒害效應;②與土壤酶的活性基團結合;③與酶的底物基質發生絡合反應;④對酶底物的競爭性抑制[31].然而植物生長過程中,污染土壤中重金屬離子對植物根系的刺激作用可促進植物分泌大量的活性物質和一些胞外酶等[28-29],同時植物的生長也為根際微生物提供有利的生存空間,因此在植物和微生物共同作用下有效的改變根-土界面的生物化學環境,從而在一定程度的改善土壤酶活性[28,32],與Cui等[33]得出的海州香薷可改善Cd和Cu污染土壤的脲酶、過氧化氫酶和酸性磷酸酶活性的研究結果一致.

表3 構樹修復下土壤pH值,酶活性和重金屬有效態含量的相關性分析Table 3 Relationship of soil pH, enzyme activities with the content of available heavy metals in soil

2.4 構樹修復下土壤微生物群落結構的變化

重金屬污染后土壤微生物數量和微生物的群落結構可能發生顯著的變化[10,34].在構樹修復重金屬污染土壤過程中,土壤微生物群落變化的DGGE圖譜見圖3.基于DGGE圖片每個條帶的強度,主要的細菌條帶隨著修復時間的延長無明顯變化,但部分細菌條帶變弱或加強,這與Wu等[35]得出的在植物修復Ni污染土壤過程中主要細菌存在于整個修復周期并與植物形成特殊的群落結構的研究結果一致.而構樹修復的不同期間,土壤中叢枝菌根真菌群落結構具有較大差異,原因可能與植物生長期、溫度、土壤重金屬的活性和其他環境因子有關.構樹修復下土壤細菌隨修復時間的延長無明顯變化,而叢枝菌根真菌群落變化明顯,與Jia等[36]得出的在Cu污染土壤植物恢復過程中,不同修復時間下土壤中主要真菌群落及其組成具有較大的變化,而細菌群落的結構和相對豐度無明顯變化的研究結果一致.因此,構樹修復重金屬污染土壤中微生物的適應與演替在污染土壤的生態修復與重建過程中扮演重要的作用.

多樣性和均勻度指數被用來衡量一個生態環境中物種的多樣性和均勻性.構樹修復下土壤中細菌和叢枝菌根真菌的香濃-威納多樣性和均勻度指數見表 4.與未修復的土壤(0d)相比,構樹修復下(60～270d)土壤細菌和叢枝菌根真菌的均勻度指數無顯著差異,但其香農-威納多樣性指數得到提高,尤其是細菌多樣性指數顯著提高(P＜0.05),原因可能是植物在生長過程中,可向根際土壤中釋放多種多樣的根系分泌物或植物根際碎片裂解物,這些化合物支撐著不同營養需求的微生物生長與繁殖[28].在構樹修復的整個周期(60～270d),細菌和叢枝菌根真菌的香濃-威納多樣性指數均比較穩定,這可能與土壤中微生物群落在長期重金屬污染的環境下對重金屬產生了抗性、耐性或適應性有關[37].因此,構樹能有效改善重金屬污染土壤的微生物活性并維持土壤微生物多樣性的穩定.

圖3 構樹修復下土壤細菌和叢枝菌根真菌的DGGE圖譜Fig.3 DGGE profiles of bacteria and arbuscular mycorrhizal (AM) fungi in contaminated soil with B. papyrifera remediation

表4 構樹修復下土壤微生物多樣性和均勻度指數Table 4 Microbial diversity and evenness index in soil remediated with B. papyrifera

將細菌和叢枝菌根真菌的DGGE圖譜數字化后,分別與環境因子結合進行冗余分析(RDA),結果如圖4所示.RDA分析的軸1和軸2之和對土壤細菌和叢枝菌根真菌群落的解釋量分別為 69.42%和 61.29%,說明 RDA排序分析能較好的反應土壤微生物(細菌和叢枝菌根真菌)與環境因子之間的關系.從圖4可看出,污染土壤中重金屬有效態含量對細菌和叢枝菌根真菌群落具有較強影響,尤其是有效態Cd,Zn和Cu對土壤中細菌和叢枝菌根真菌群落的影響較大,與大多數研究表明污染土壤中重金屬可改變土壤微生物的活性和組成的研究結果一致[10-11].而且土壤中脫氫酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性與重金屬有效態含量均呈負相關,進一步表明土壤中重金屬有效態含量對土壤酶活性的不利影響,與表3結果一致.從圖4可進一步看出,土壤pH值與脫氫酶、蔗糖酶和酸性磷酸酶活性具有較強的相關性,土壤 pH值的變化主要來源于構樹修復重金屬污染土壤過程中根系分泌物(如檸檬酸、蘋果酸、富里酸等),進而改善污染土壤酶活性,與Hou等[38]得出的東南景天可降低土壤pH值,提高土壤重金屬生物有效性,同時增加根際微生物的活性的研究結果一致.因此,構樹有利于提高重金屬污染土壤的酶活性,同時提高土壤中微生物的活性,促進共代謝作用,進而有助于污染土壤的生態恢復與重建.

圖4 細菌和叢枝菌根真菌群落與環境因子的RDA排序圖Fig.4 RDA ordination diagram of bacteria and AM fungi communities associated with environmental factors

3 結論

3.1 盆栽試驗結果表明,構樹可有效吸收污染土壤中Cd和Zn.經270d培養后,構樹地上部分Cd和Zn富集總量分別達1.17和38.2mg/pot.

3.2 構樹修復可有效提高污染土壤酶活性和微生物多樣性.經 270d培養后,構樹修復污染土壤中蔗糖酶和酸性磷酸酶活性與未修復土壤相比顯著(P＜0.05)提高3.12倍和2.29倍.通過16S和18S rDNA PCRDGGE分析表明,構樹修復可提高污染土壤中細菌和叢枝菌根真菌的多樣性,并維持污染土壤中微生物群落的穩定.

3.3 構樹修復可有效改善重金屬污染土壤的酶活性和微生物群落結構等生物學特性,然而土壤重金屬有效態含量下降不明顯,必須輔助物理和化學措施來強化構樹對重金屬污染土壤的生態修復效果.