血清lncRNA CRNDE對晚期結直腸癌一線FOLFOX方案化療療效和預后的預測作用

李玉霞，黃文偉，劉俊，熊芹

漢川市人民醫院腫瘤科，湖北 漢川432300

結直腸癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，其發病率逐年上升，隨著多學科團隊的建立和治療模式的逐步成熟和完善，其病死率在多個國家均有下降[1]。目前5-氟尿嘧啶（5-Fu）仍是結直腸癌化療的基本用藥，以5-Fu為主藥的奧沙利鉑聯合5-Fu和亞葉酸鈣（FOLFOX方案）可使轉移性結直腸癌患者的中位生存時間由8個月延長至16.2～19.5個月[2]。但晚期結直腸癌一線FOLFOX方案化療的總體有效率約為70%，如何在治療初始篩選出對一線FOLFOX方案化療可能無效的患者，進行化療方案的調整和個體化的治療顯得極為迫切[3]。目前，長鏈非編碼 RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在多種惡性腫瘤中存在差異表達，在各種腫瘤的早期診斷、預后和療效預測方面已進行了廣泛的研究[4-5]。研究表明，部分lncRNA如GAS5[6]、TINCR[7]在結直腸癌轉移中的作用機制已獲得了初步的探索，但目前尚缺乏針對轉移性結直腸癌FOLFOX方案治療的無創性療效預測的研究。本研究通過對晚期結直腸癌患者的血清lncRNA表達譜進行分析，篩選出潛在的預測一線FOLFOX方案療效的差異lncRNA，并從中挑選出結直腸腫瘤差異表達基因（colorectal neoplasia differentially expressed，CRNDE），進一步探討CRNDE對晚期結直腸癌患者預后的預測價值，最后對CRNDE的靶基因進行預測，并對靶基因功能進行分析，旨在探索晚期結直腸癌的新型預后標志物，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2011年1月于漢川市人民醫院就診的7例晚期結直腸癌患者的臨床資料，根據其對一線FOLFOX方案化療的療效分為兩組（反應良好組和反應不良組）。腫瘤初次評估指運用FOLFOX方案化療3個周期后，于初始治療開始后第2個月進行療效評估。根據實體瘤療效評價標準（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）進行療效評估。其中，完全緩解（CR）為未檢測到腫瘤病灶；部分緩解（PR），所有可測量的腫瘤最長徑之和縮小30%以上；疾病穩定（SD），介于PR和疾病進展（PD）之間；PD，所有可測量的腫瘤最長徑之和增大超過20%。其中反應良好組患者（CR+PR）4例，反應不良組患者（SD+PD）3例。搜集治療前患者的血清樣本，對兩組患者的血清樣本進行lncRNA表達譜分析，篩選差異表達的lncRNA，選擇CRNDE進一步分析。回顧性分析2011年2月至2013年2月于漢川市人民醫院就診的74例晚期結直腸癌患者的臨床資料，分析血清CRNDE表達水平與晚期結直腸癌患者臨床特征及預后的關系。最后通過生物信息學分析，預測CRNDE的靶基因，并對靶基因進行信號通路分析。納入標準：①既往無其他惡性腫瘤史；②既往未行任何全身放療；③未合并同時性多源癌。術后2年內，每3個月隨訪1次，術后第3～5年，每6個月隨訪1次，之后每年隨訪1次。

1.2 試劑和設備

Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司，Nano-Drop 2000分光光度計購自美國Applied Biosystems公司，ABI 7500實時定量PCR儀購自美國ABI公司，PrimeScript RT reagent Kit和 SYBR Premix Ex-TaqⅡKit均購自日本Takara公司，Agilent Human lncRNA Microarray 4×180k芯片購自美國安捷倫公司。

1.3 RNA提取、lncRNA芯片檢測、CRNDE的qRT-PCR檢測

抽取清晨空腹外周血5 ml置于離心管，37℃恒溫培養箱斜置2 h，4℃斜置4 h，析出血清移至離心管中。4℃下3197 r/min離心10 min，吸取上清1.5 ml。4℃下5055 r/min離心10 min，吸取上清轉至1.5 ml離心管中，-80℃保存。按照Trizol試劑盒說明書提取血清樣本總RNA，定量測定RNA濃度和純度。當吸光度（A260/A280）為1.9～2.1時，認為RNA的純度較高，可用于下一步分析。lncRNA芯片檢測由上海歐易生物科技有限公司完成，差異lncRAN的標準為反應良好組與反應不良組表達相差1.2倍以上且差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步挑選CRNDE進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）驗證，根據 PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix ExTaqⅡ Kit說明書逆轉錄提取RNA后進行qRT-PCR，以18S rRNA為內參。

1.4 lncRNA靶基因預測與信號通路分析

運用MEM-Multi Experiment Matrix在線數據庫進行CRNDE的靶基因預測，并運用FunRich軟件對CRNDE的靶基因數據集進行信號通路分析[8]，探討CRNDE的生物學功能。

1.5 統計學方法

繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC），評價血清CRNDE對晚期結直腸癌一線FOLFOX方案療效的預測價值。采用X-tile 3.6.1軟件進行CRNDE的截點設置，并根據設置的截點分為高表達組和低表達組。采用SPSS 13.0軟件對數據進行統計分析，計數資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 差異lncRNA的篩選

2011年1 月就診的7例患者中，4例患者反應良好，3例患者反應不良，對其血清lncRNA表達譜進行比較分析，共篩選出356個差異表達的lncRNA；其中，反應良好組上調lncRNA共125個，下調lncRNA共231個。由于CRNDE的P值最小，篩選CRNDE進一步分析。（表1）

表1 反應良好組和反應不良組患者的差異lncRNA（ P值前 5名）

2.2 CRNDE對療效的預測價值

2011年2 月至2013年2月就診的74例晚期結直腸癌患者中，反應良好者43例，反應不良者31例。ROC曲線分析顯示，血清CRNDE預測晚期結直腸癌一線FOLFOX方案化療療效的AUC為0.691（95%CI：0.562～0.819），P=0.005。（圖1）

圖1 血清CRNDE預測晚期結直腸癌一線FOLFOX方案化療療效的ROC曲線

2.3 CRNDE對預后的預測價值

以5年總生存率為終點結局事件，運用X-tile軟件對CRNDE的表達水平進行截點設置。結果提示，CRNDE相對表達量=6.6為最佳分組截點，進一步以6.6為截點分為CRNDE高表達組（n=8）和CRNDE低表達組（n=66）。對兩組患者的總生存率進行比較，結果顯示，CRNDE高表達組患者的5年總生存率低于CRNDE低表達組（0 vs 31%），CRNDE高表達組患者的中位生存時間為9.7個月（95%CI：7.0～11.2），明顯短于低表達組的36.0個月（95%CI：24.4～40.0），差 異 有 統 計 學 意 義（χ2=23.504，P=0.001）。（圖2、圖3）

圖2 X-tile軟件對CRNDE表達水平的截點設置

圖3 CRNDE高表達組與低表達組結直腸癌患者的生存曲線

2.4 血清 CRNDE表達水平與晚期結直腸癌患者臨床特征的關系

對CRNDE高表達組和CRNDE低表達組患者的臨床特征進行比較，結果顯示，不同性別、年齡、腫瘤部位、初始肝轉移數目的晚期結直腸癌患者的CRNDE表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。而CRNDE低表達組患者的反應良好率高于CRNDE高表達組，差異有統計學意義（P=0.044）。（表2）

表2 血清CRNDE表達水平與晚期結直腸癌患者臨床特征的關系

2.5 CRNDE的靶基因預測

應用MEM-Multi Experiment Matrix在線數據庫進行CRNDE的靶基因預測，選取排名前50的靶基因，構建靶基因數據集。運用FunRich軟件對CRNDE的靶基因數據集進行信號通路分析，結果提示CRNDE的靶基因主要富集于單核苷酸替換途徑拆分AP位點（resolution of AP sites via the singlenucleotide replacement pathway）和 5'→3'的 mRNA的降解外切（mRNA decay by 5'to 3'exoribonuclease）等信號通路上。（圖4）

圖4 CRNDE靶基因數據集的信號通路分析

3 討論

研究報道，轉移性結直腸癌患者的5年生存率仍不足40%，即使使用了西妥昔單抗或貝伐珠單抗，也不能延長其無進展生存期[9]，而影響其長期預后的主要因素為一線化療方案的療效[10]。因此，對一線全身化療方案的療效進行精準預測，有助于化療方案的選擇和個體化診療。有研究通過對CT參數進行分析，構建了能夠預測轉移性結直腸癌對一線FOLFOX方案和伊立替康+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣（FOLFIRI方案）的化療預測模型，但該模型僅能在治療結束后或手術前使用，無法在初始治療時即預測其療效[10]。目前關于診斷性、療效預測性或具有預后價值的lncRNA被不斷發掘，并應用于腫瘤的臨床研究中[11]。lncRNA可通過調節RNA的表達、代謝和修飾，在轉錄后水平發揮作用，但其具體機制尚不明確[11]。Shen等[12]研究發現lncRNA BANCR與結直腸癌的淋巴結轉移有關，且其上調常提示不良預后。此外，lncRNA GAS5亦被證實與結直腸癌的淋巴結轉移有關[6]。但既往研究多使用腫瘤組織樣本進行lncRNA檢測。本研究首先對4例反應良好和3例反應不良結直腸癌患者的血清lncRNA表達譜進行比較分析，從而對血清lncRNA進行初篩。因本研究于所有全身治療前采集患者血液并檢測血清CRNDE水平，可用于療效預測，且為無創操作，有一定的臨床應用前景。然后本研究進一步選擇CRNDE進行分析，結果提示CRNDE可預測晚期結直腸癌一線FOLFOX方案的療效，其AUC為0.691。

本研究通過血清qRT-PCR驗證發現，CRNDE低表達組患者的反應良好率高于CRNDE高表達組，進一步的生存分析亦提示CRNDE高表達組患者的預后不良。提示CRNDE表達上調不僅與腫瘤局部進展有關，還與腫瘤對標準方案化療的敏感性和生存率有關。Wang等[13]研究發現，在胰腺癌中CRNDE可通過“吸附”miRNA-384，增加胰島素受體底物 1（insulin receptor substrate 1，IRS1）的表達，從而促進胰腺癌細胞的增殖和侵襲。而在結直腸癌中，細胞水平研究提示，CRNDE可通過表觀遺傳學調控機制，沉默DUSP5/CDKN1A的表達，從而促進結直腸癌細胞的增殖[14]。但是CRNDE在結直腸癌耐藥方面的作用機制目前尚無研究。基于此，本研究進一步運用生物信息學手段對CRNDE的靶基因進行預測，并對這些靶基因進行信號通路分析。結果提示，CRNDE可能通過調節mRNA的降解和表達，從而發揮其生物學作用，與前述的機制（增加IRS1表達、沉默DUSP5/CDKN1A表達）相符，為臨床耐藥靶標的設計提供了參考。

綜上所述，血清CRNDE可作為轉移性結直腸癌一線FOLFOX方案療效預測的潛在無創血清標志物，并與患者的預后相關。