結(jié)球菊苣葉總黃酮提取工藝研究

劉馨瑤， 李金秒， 張利萍， 張萬忠

(沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

結(jié)球菊苣(knot ball chicory)又稱為紅菊苣，菊科，屬多年生草本植物，是一種葉菜，是海水蔬菜的一種，起源于地中海沿岸中亞和北非，歐美國家普遍種植，特雷維索紅菊苣和維羅納紅菊苣享有巨大的好評,當(dāng)?shù)孛磕晟a(chǎn)250 000 t[1].菊苣含有大量的天然化學(xué)成分，如菊糖、有機酸類、生物堿類、香豆素類、三萜類、倍半萜內(nèi)酯類等，現(xiàn)已確定的化合物有乙酸降香萜烯醇脂、α-香樹脂醇、蒲公英萜酮、胡蘿卜苷、山萵苣苦素、菊粉、高果糖漿、低果聚糖等[2].人類早在古代就開始使用菊苣，主要是利用它的藥用價值，即健胃消食，也可用于解葷膩，還有清肝利膽的功效.結(jié)球菊苣同樣具有抗氧化活性,結(jié)球菊苣中水溶性黃酮類化合物存在著特殊效用,流行病學(xué)研究描述了許多類黃酮對預(yù)防癌癥、心血管疾病和衰老的有益影響[3].結(jié)球菊苣提取物具有許多的生理活性,比如抗炎作用、增強免疫能力、降低血糖和膽固醇等[4-5].菊苣根可增進消化器官的活動機能，增強食欲；高濃度根制劑可增強胃分泌，卻不增進平滑肌張力[6].隨著人們生活水平的不斷提高，人們對綠色食品市場需求也不斷增加，而菊苣由于味道有些苦，從而減少了蟲害，避免了大量使用農(nóng)藥，其可以作為蔬菜食用[7-8].

目前，對黃酮類物質(zhì)的提取研究在國內(nèi)外已經(jīng)成為一個熱點，黃酮類化合物是以2-苯基色原酮為母核的多酚類化合物，常連接甲基、甲氧基、異戊烯基、酚羥基等官能團,可與糖結(jié)合生成苷[9-10].植物中含有豐富的黃酮類化合物，黃酮普遍應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化工等領(lǐng)域中[10-11].結(jié)球菊苣中含有豐富的黃酮、皂苷、多糖和三萜類化合物，本實驗以結(jié)球菊苣葉為原料，探討乙醇加熱回流提取法提取結(jié)球菊苣葉中總黃酮的工藝，從而為結(jié)球菊苣的綜合利用提供參考.

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

結(jié)球菊苣，海城市三星生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司；蘆丁對照品，索萊寶公司；無水乙醇、體積分?jǐn)?shù)95 %乙醇、亞硝酸鈉試劑、硝酸鋁試劑、氫氧化鈉試劑均為分析純.

FA1104電子天平，沈陽杰龍儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；RE-6000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生物儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器責(zé)任公司；WFZ-UV 2000紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的處理

將結(jié)球菊苣葉風(fēng)吹除塵，真空干燥，粉碎研磨，過40目篩，得結(jié)球菊苣粉末，留存?zhèn)溆?

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照藥典[12]所記載測定繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，精密稱取蘆丁對照品3.2 mg放置于100 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70 %的乙醇至刻度，混合均勻，制成質(zhì)量濃度為0.032 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次精密稱取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別置于試管中，各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %的亞硝酸鈉0.6 mL，搖勻，靜置6 min，各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的硝酸鋁0.6 mL，搖勻，靜置6 min，再各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %的氫氧化鈉4 mL，搖勻，靜置15 min，以第一瓶作為空白對照，在510 nm處測其紫外吸光度，依次記錄數(shù)據(jù)，并繪制以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.3 總黃酮提取工藝流程

結(jié)球菊苣粉末→加熱回流提取→過濾→提取液濃縮→干燥→菊苣總黃酮含量測定.

1.2.4 總黃酮提取的單因素試驗

以總黃酮的提取率為分析指標(biāo)，分別研究比較不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度、料液比(質(zhì)量體積比，以下同)對結(jié)球菊苣總黃酮提取率的影響.

1.2.5 總黃酮提取的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、料液比(D)作為試驗因素進行正交設(shè)計，因素水平表見表1.

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal experimental factors level table

1.2.6 驗證實驗

稱取結(jié)球菊苣粉末10 g，平行3份，在1.2.5所得最佳提取工藝條件下提取結(jié)球菊苣中的總黃酮，計算提取率.

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1.對不同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，由小到大，分別測吸光度.線性回歸得到吸光度與質(zhì)量濃度關(guān)系式：

y=1.249 0x-0.006 9，R2=0.999 5.

圖1 標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線Fig.1 Rutin standard curve

2.2 總黃酮提取率的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱量5份結(jié)球菊苣葉粉末，以1∶20的料液比例，依次加入體積分?jǐn)?shù)為30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %的乙醇，80 ℃恒溫水浴回流2 h，趁熱過濾，濃縮，測吸光度，計算黃酮含量，得乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖2.

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響Fig.2 The influence of ethanol concentration of flavonoids extraction yield

由圖2可知：乙醇體積分?jǐn)?shù)在70 %以后開始波動，在70 %處出現(xiàn)最大值，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)偏低或偏高時，黃酮提取率均有所降低.這是由于中等體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液的極性同結(jié)球菊苣中黃酮的極性相近，故黃酮可以更好地溶解析出；低體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液的極性會比較大，故雜質(zhì)比較容易溶解，雜質(zhì)含量升高，所得的黃酮提取率就較低[13]；體積分?jǐn)?shù)大的乙醇水溶液吸水性強，極性小，改變了細(xì)胞的溶脹，故而黃酮提取率降低[14].

2.2.2 提取時間對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70 %、提取溫度80 ℃、料液比1∶20條件下，提取時間分別為1、2、3、4、5 h，研究提取時間對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3.

圖3 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.3 The influence of extraction time on flavonoids extraction yield

由圖3可知：提取時間4 h效果最好；開始時隨著時間的延長，黃酮類物質(zhì)溶解的越來越多，提取率升高；后來隨著時間過長，提取率反而下降.這可能是由于提取過程中，時間的增加會引起乙醇揮發(fā)；此外，長時間的水浴加熱也可能改變結(jié)球菊苣葉中黃酮類化合物的活性成分結(jié)構(gòu)，從而穩(wěn)定性降低，影響提取率[15].

2.2.3 提取溫度對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70 %、料液比1∶20、水浴回流4 h的條件下，研究提取溫度對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4.由圖4可知：在60、70、80 ℃時，溫度對提取率的影響達(dá)到峰值，且基本穩(wěn)定.這主要是因為溫度升高溶解度增大，溫度再升高，提取率反而降低.

圖4 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.4 The influence of extraction temperature on flavonoids extraction yield

2.2.4 料液比對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70 %、提取溫度70 ℃、恒溫水浴回流4 h的條件下，研究料液比對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖5.由圖5可知：當(dāng)料液比為1∶40時提取率最高，提取效果最好.

圖5 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.5 The influence of material liquid ratio on flavonoids extraction yield

2.3 正交試驗結(jié)果

按照表1進行正交試驗，試驗結(jié)果見表2.

由表2可知：乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度、料液比4個因素對結(jié)球菊苣葉總黃酮提取率的影響順序為提取溫度(C)>料液比(D)>乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)>提取時間(B).方差分析結(jié)果見表3，由表3可知：提取溫度(C)對黃酮提取率有顯著影響，而乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取時間(B)、料液比(D)對提取率影響不大.最優(yōu)水平搭配為A1B3C1D3，即料液比1∶45，乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %，60 ℃加熱回流提取4 h.

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The orthogonal experiment design and result

表3 總黃酮提取率方差分析Table 3 Flavonoids extraction yield anova table

2.4 優(yōu)化工藝驗證實驗

取3份結(jié)球菊苣粉末，每份10 g，按上述最優(yōu)提取工藝條件進行驗證實驗，測得平均總黃酮提取率為4.11 %.

3 結(jié) 論

以結(jié)球菊苣總黃酮的提取率為考察分析指標(biāo)，采用乙醇加熱回流法提取結(jié)球菊苣中的總黃酮，通過對乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、提取溫度、料液比進行單因素試驗和正交試驗，優(yōu)選出結(jié)球菊苣總黃酮提取的最佳工藝條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %、提取時間4 h、提取溫度60 ℃、料液比1∶45.在所選最佳工藝條件下，進行驗證實驗，平均提取率為4.11 %.