利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術定向降低水稻落粒性

盛夏冰，譚炎寧，孫志忠，余東，汪雪峰，袁貴龍，袁定陽，段美娟

（1湖南農業大學生物科學技術學院，長沙410128；2湖南雜交水稻研究中心雜交水稻國家重點實驗室，長沙410125）

0 引言

【研究意義】水稻的易落粒性狀不僅造成稻谷收獲產量的損失，而且不適于機械化收割。某些水稻品種（組合）因落粒性強導致收獲產量損失程度高達5.8%—8.6%[1]，且因水稻機械化生產方式的普及，使易落粒品種在實際生產過程中受到更嚴重的產量損失；因此，加強對水稻品種落粒性的遺傳改良對于保證水稻穩產和適于機械化生產均具有重要意義。【前人研究進展】基因編輯是一項以核酸酶作為基礎工具，對生物體基因組中的特定基因進行靶向“修飾”，從而創制預期目標性狀的定向遺傳改良技術。目前常見的基因編輯技術主要有鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）[2]、轉錄激活子樣效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）[3]和CRISPR/Cas核酸酶（規律成簇間隔短回文重復序列，clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nucleases）[4]等為工具的3種技術體系，作為第三代基因編輯技術—CRISPR/Cas是一類來源于細菌和古細菌體內的獲得性免疫防御系統[5-7]，與 ZFNs、TALENs技術相比具有更加簡單、高效等優勢。2012年JINEK等[8]研究發現TypeⅡCRISPR/Cas系統的Cas9核酸酶結合crRNA和tracrRNA 2個RNA分子就可以切割雙鏈DNA，奠定了 CRISPR/Cas9技術應用的理論基礎；2013年ZHANG 等[6]和 MALI等[9]分別在《Science》雜志上發表了2篇基于CRISPR/Cas9技術改造人類與小鼠細胞系基因組的文章，引領了該技術的發展。近年來，CRISPR/Cas9技術已被成功應用于動物[10]、植物[11-13]和微生物[14]的基因組定點編輯。在水稻遺傳改良中，該技術已成功實現了對抗性、產量、品質和育性等相關基因的定點編輯，如XU等[15]利用CRISPR/Cas9技術對抗除草劑基因BEL為靶點進行定點突變，成功獲得對除草劑-苯達松敏感的突變體水稻材料；WANG等[11]對OsERF922進行定向編輯，提高了受體水稻材料對稻瘟病的抗性；ZHOU等[12]以水稻溫敏不育基因TMS5為靶點，成功培育了水稻工程溫敏不育系；ZONG等[13]等利用CRISPR/Cas9技術成功構建了水稻基因組定點替換體系。這些成功案例的報道，使得CRISPR/Cas9基因編輯技術在水稻定向遺傳改良中的應用越來越廣泛。目前，多個控制水稻落粒性的主效基因/QTL已被定位在水稻基因組中不同的染色體上[16-21]。qSH1是控制水稻落粒性的主效基因之一，其在小穗基部的離層持續表達促進了離層的形成，導致水稻籽粒易脫落。研究進一步發現，在qSH1開放閱讀框 12 kb處 5′端調控區存在一個能夠影響 ABI3型轉錄因子與RY重復序列結合的SNP變異（G/T），該位點以基因型T存在時能阻礙qSH1的表達，從而抑制離層形成及產生難落粒表型；反之，當其基因型為G時，能維持qSH1的持續表達促進落粒。利用該SNP（TT）對易落粒品種Kasalath中的qSH1基因型進行替換后，因近等基因系中qSH1的表達得到了明顯抑制而表現出了難落粒的表型[22]。王軍等[23-24]通過對江蘇、黑龍江、廣東等地區的39份落粒性極強的雜草稻的qSH1等落粒性主效基因的序列分析，證明qSH1是控制這些地區雜草稻極易落粒表型的主效基因且該SNP位點都表現出一致的“GG”基因型。此外，研究發現qSH1對其他落粒性控制位點間存在上位效應和互作關系。ONISHI等[25]研究來自23份不同水稻資源的3個水稻落粒性基因（qSH1、qSH3和qSH4即Sh4），發現在qSH3和qSH4存在時，qSH1的突變可顯著地把易落粒表型轉變為難落粒，由此說明qSH1對其余 2個水稻落粒性基因具有明顯的上位效應。ZHOU等[21]通過原位雜交解析3個與水稻離層發育相關的主效基因（qSH1、Sh4和SHAT1）的遺傳關系，發現qSH1在幼穗分化后期開始表達，并作用于Sh4、SHAT1的下游，通過維持其穩定表達，從而促進小穗離層結構的形成。【本研究切入點】前人對水稻落粒性基因/QTL的定位及關聯分析表明，qSH1是控制水稻落粒性的關鍵主效基因，而傳統的遺傳改良的方法存在效率低、耗地多及不定向等不足。利用基因編輯技術對水稻落粒性主效基因qSH1進行定點編輯，可從分子遺傳學層面定向、高效地改良水稻易落粒性這一復雜農藝性狀。【擬解決的關鍵問題】本研究選取了一個綜合性狀優良但易落粒的大穗型雜交稻骨干親本 HR1128為受體材料，以落粒性基因qSH1為靶點，利用CRISPR/Cas9技術進行定點編輯，定向改良其落粒性過強的不足。以期為保證水稻穩產和機械化生產創制重要的材料基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以HR1128為轉化受體親本，2014—2017開展常規的轉基因試驗，轉基因水稻材料種植于湖南雜交水稻研究中心長沙轉基因試驗基地，常規田間種植及水肥管理。

pYLgRNA-U3/U6a載體及pCRISPR/Cas9表達載體由華南農業大學劉耀光院士惠贈，試驗所用引物（電子附表 1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，測序由湖南擎科生物技術有限公司完成，BsaⅠ、T4 DNA ligase、KOD FX分別購置于NEB、寶生物工程（大連）有限公司、東洋紡（上海）生物科技有限公司，其余分子試劑均購置于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 靶點設計與CRISPR/Cas9表達載體的構建

理論上，在基因的編碼區域或者5′-UTR區域進行編輯可能改變基因翻譯后的蛋白產物結構或影響該基因的表達水平，是失活基因功能或抑制基因表達的2種基本策略。根據CRISPR/Cas9系統識別原型間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）上游約20個核苷酸序列的特點，在水稻落粒性基因qSH1（LOC_Os01g62920）上設計了 2個靶位點，分別命名為 qSH1-T1和 qSH1-T5（圖 1-A）（qSH1-T1 序列 5′-GCGCCATGTCGTCCGCCGCT-3′，PAM 序列為 5′-GGG-3′，qSH1-T5 序列 5′-ACATGGC GCGCACGCACGTA-3′（qSH1反向互補鏈），PAM序列為5′-CGG-3′）。2個靶點的主要靶標區域分別在qSH1第一個外顯子區域和 5′-UTR區域，以便獲得qSH1生物學功能喪失或表達量降低的突變體后代。靶點的特異性通過信息網站Cas-OFFinder和NCBI中水稻基因組BLAST對比分析驗證，發現2個靶點不會或不易引起脫靶效應。

參照 MA等[26]的方法構建雙靶點表達載體pYLCRISPR/Cas9- qSH1-T51。（1）構建含qSH1-T5和qSH1-T1雙靶點的pYLgRNA-U3、pYLgRNA-U6a載體：分別合成帶有黏性末端的寡鏈靶點引物 qSH1-T5F/qSH1-T5R和qSH1-T1F/qSH1-T1R。將2對寡鏈靶點引物變性后冷卻至室溫完成退火，然后將退火后的2個片段分別接連到pYLgRNA-U3和pYLgRNAU6a載體上，并利用PCR分別擴增獲得含有qSH1-T5和qSH1-T1靶點的gDNA表達盒U3-qSH1T5-gRNA和U6a-qSH1T1-gRNA；（2）構建含qSH1-T5和qSH1-T1靶點片段的pYLCRISPR/Cas9表達載體：用接頭引物b1/B2和 b2/BL分別對 U3-qSH1T5-gRNA和 U6aqSH1T1-gRNA表達盒進行PCR擴增，再用BsaⅠ酶、T4 DNA ligase將所有擴增產物與pYLCRISPR/ Cas9-MT表達載體同時進行酶切和連接，構建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表達載體。（3）轉化及測序驗證：將連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，挑取單菌落擴繁培養，抽提質粒DNA后用AscⅠ酶切鑒定檢測，并挑選AscⅠ酶切正確的質粒DNA用檢測引物SP1/SP2（電子附表1）進行PCR擴增，回收擴增產物送湖南擎科生物技術有限公司測序。將通過酶切和測序驗證正確的表達載體轉化農桿菌感受態EHA105。

圖1 gRNA靶位點及pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表達載體組裝示意圖Fig. 1 Target sites of the gRNA in the qSH1 gene and construction of the pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51 vector

1.3 轉基因陽性植株的獲得

使用構建好的陽性農桿菌株轉化水稻品種HR1128的愈傷組織，用潮霉素篩選得到的再生組培苗，即為T0代植株（水稻遺傳轉化委托武漢伯遠生物科技有限公司完成）。采用 CTAB法[27]提取 T0代植株的基因組 DNA，用潮霉素基因特異引物 hpt-F1/hpt-R1（電子附表1）進行PCR擴增，能擴增出目的片段的植株即為T0代轉基因陽性植株。

1.4 靶位點檢測

為檢測靶位點的突變情況，跨 qSH1-T1和qSH1-T5 2個靶點設計靶點檢測引物 qSH1-JC-F1/qSH1-JC-R1（電子附表1），擴增產物片段大小約為671 bp。用qSH1-JC-F1/qSH1-JC-R1對T0代轉基因陽性株進行PCR擴增，將擴增產物送湖南擎科生物技術有限公司測序。利用 MAGE4.0分析測序結果，在靶點位置出現雙峰、套峰的植株即為T0代突變植株。再將突變植株的擴增產物進行TA克隆，隨機挑選10個單克隆測序，測序結果與野生型序列進行對比以分析突變類型及基因型。

1.5 無T-DNA元件的qsh1突變系的獲得

篩選得到的 T0代突變株自交結實后得到 T1代種子，將 T1代種子播種成苗移栽后提取葉片基因組DNA，用hpt-F1/ hpt-R1引物（電子附表1）進行PCR擴增，擴增不出目的條帶的植株即為無 T-DNA成分的T1代單株。再對上述單株用qSH1-JC-F1/ qSH1-JCR1（電子附表1）引物進行靶點PCR擴增并測序分析，篩選純合突變單株即為T1代無T-DNA成分的qsh1純合突變體。對上述篩選的qsh1純合突變體自交加代，獲得T2代qsh1突變系。

1.6 潛在脫靶位點分析

利用NCBI、Gramene的BLAST工具選取Oryza sativa IndicaGroup為參考序列，篩選與每個sgRNA序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位點作為潛在脫靶位點，評估各個靶位點的脫靶效應。每個潛在脫靶位點分別檢測T0代、T1代轉基因陽性植株。

1.7 落粒性測定分析

采用隨機分區設計種植無T-DNA成分的qsh1突變系及HR1128野生型對照，3個重復，每個小區中各株系種5行，每行8株。每個株系黃熟后取中間5株的主穗測定其穗尖籽粒的脫落拉力，每穗各測定10粒，每個株系設置3個重復。脫落拉力采用拉力計測定，各株系測定的拉力值采用SPSS13.0計算平均值和標準差，并利用單因素方差分析法比較不同株系間拉力值的差異，顯著性差異水平為P≤0.05，計算得出的平均拉力值與該株系的落粒性呈負相關性。

1.8 qsh1突變系主要穗部農藝性狀考查與分析

于成熟期，選擇qsh1突變系和HR1128野生型材料的主穗，考查每穗總粒數、結實率并隨機稱取250粒飽滿種子的質量換算成千粒重，每個株系各考查5個單株。獲得的數據采用SPSS13.0進行統計分析。

1.9 qsh1突變系qSH1相對表達量分析及編碼氨基酸序列預測分析

提取黃熟期qsh1突變系和HR1128野生型穗部總RNA，并反轉錄合成第1鏈cDNA。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析qSH1在突變體和野生型中的表達水平，其中以qSH1-Q-F/qSH1-Q-R目的基因引物（擴增區段位于qSH1第 2個外顯子區）、UbQ5-Q-F/UbQ5-Q-R為內參基因引物，利用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達量。同時，采用 MAGE4.0和DNAMAN對突變體和野生型qSH1編碼的第一個外顯子氨基酸序列進行進一步的預測比對分析。

2 結果

2.1 qSH1靶點設計和pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表達載體構建

根據 CRISPR/Cas9技術的原理并結合qSH1的cDNA序列，在起始密碼子附近找到2條長度為20 bp特異性好的片段，將其設計為 2個靶點 qSH1-T5和qSH1-T1（圖 1-A）。然后利用酶切連接、PCR等方法將qSH1-T5、qSH1-T1與gRNA表達盒連接，最后再將 2個連接成功的靶點-gRNA同時組裝至pYLCRISPR/Cas9-MT表達載體（圖1-B）。組裝好的表達載體 2個靶點-gRNA表達盒分別由OsU3和OsU6a啟動子驅動，Cas9由Ubi啟動子驅動。

2.2 T0代轉基因陽性苗的獲得及qSH1編輯情況分析

用含有 pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表達載體的農桿菌轉化HR1128，獲得T0代再生苗。載體特異引物 hpt-F1/hpt-R1（電子附表 1）檢測結果表明，獲得的20株T0代再生苗中有11株為轉基因陽性苗，轉基因陽性率為55%。再對獲得的轉基因陽性苗用靶點檢測引物qSH1-JC-F1/ qSH1-JC-R1（電子附表1）對qSH1靶點上下游區域進行PCR擴增，并將擴增產物進行測序分析，結果表明，有7株轉基因陽性苗在qSH1靶點位置發生了編輯（圖2），其中T1靶點的突變頻率為54.55%、T5靶點的突變頻率為63.64%、T1和T5靶點同時突變的頻率為 54.55%（T1靶點發生突變的單株，其在T5靶點都發生了突變）。

進一步對7個突變單株靶點擴增產物進行TA克隆，并隨機挑選10個單克隆測序分析，結果表明，qSH1的突變基因型包括純合突變、雜合突變、雙等位突變和嵌合突變，突變類型包括堿基插入、堿基缺失及堿基替換（表1）。

2.3 無T-DNA成分的qsh1突變系的獲得

為獲得不含 T-DNA成分且突變位點能穩定遺傳的qsh1突變系，將7個T0代qsh1突變單株自交繁殖，構建7個T1代qsh1突變群體。利用hpt-F1/hpt-R1和qSH1-JC-F1/qSH1-JC-R1引物（電子附表1）對T1代突變群體中單株的載體序列和靶點區域進行擴增測序分析。發現在T1代植株中Cas9載體骨架和qSH1突變位點都發生了分離（圖 3），并篩選獲得 2種突變類型不同且無T-DNA成分的qsh1純合突變。將上述2種純合突變株自交加代，進一步構建2個T2代qsh1純合突變系群體，命名為17SZ01和17SZ02（圖4）。

圖2 2個靶位點的測序結果Fig. 2 Sequencing result for the two target sequences

表1 T0代突變體突變基因型比率、突變類型比率Table 1 The genotype ratios and mutation type ratios of T0 plants

2.4 CRISPR/Cas9系統潛在脫靶效應的分析

根據靶位點 qSH1-T5、qSH1-T1序列與Oryza sativa IndicaGroup參考序列的比對結果，篩選出的3個潛在脫靶位點。并對獲得的 T0和 T1代轉基因陽性植株46株進行潛在脫靶位點PCR擴增測序，結果比對分析發現，所有被檢測植株的潛在脫靶位點均沒有發生突變（表2）。

2.5 qSH1編輯后代落粒性的測定及主要穗部農藝性狀的考查分析

于成熟期，采用拉力計對qsh1純合突變系17SZ01、17SZ02及HR1128野生型對照單株主穗或大分蘗穗尖部的籽粒脫落拉力進行測定分析。結果表明，所測定的T2代qsh1純合突變系的拉力值與野生型對照相比顯著增加（拉力值分別為（116.38±15.48）g和（103.73±15.70）g），由此說明qsh1純合突變系的落粒性呈現顯著性降低（圖5）。同時，對qsh1突變系、HR1128野生型材料的每穗總粒數、結實率、千粒重等幾項主要穗部農藝性狀進行考查統計分析發現，各項指標在突變系和野生型材料間均無顯著性差異（表3）。

圖3 部分qsh1突變株T-DNA成分的PCR鑒定Fig. 3 PCR identification for the T-DNA elements of parts of the qsh1 mutants

圖4 T2代2種不同類型qsh1純合突變的突變類型分析Fig. 4 Mutation types of two types qsh1 homozygotes in T2 generation

表2 CRISPR/Cas9-qSH1-T51潛在脫靶位點的檢測Table 2 Mutation detections in the putative CRISPR/Cas9-qSH1-T51 off-target sites

圖5 T2代qsh1純合突變系及HR1128野生型落粒性分析Fig. 5 The seed shattering of qsh1and HR1128 in T2 generation

表3 qsh1突變系和HR1128野生型主要穗部農藝性狀調查Table 3 Major panicle agronomic traits of qsh1 mutants and HR1128 WT

2.6 突變系qSH1的qRT-PCR檢測及氨基酸序列預測分析

對qsh1純合突變系17SZ01、17SZ02及HR1128野生型對照黃熟期穗部qSH1進行qRT-PCR檢測并對其相對表達量進行計算分析，發現與野生型對照相比，17SZ01突變系qSH1的相對表達量顯著降低（圖6），而17SZ02突變系qSH1的相對表達量無顯著差異。

同時對2個qsh1純合突變系編碼蛋白的氨基酸序列進行預測比對，發現17SZ01和17SZ02均由于靶點T1的插入突變引發qSH1第一個外顯子編碼區移碼，從而導致氨基酸翻譯發生改變并提前終止（圖7）。

3 討論

CRISPR/Cas9技術是目前最前沿的基因編輯技術，相對于鋅指蛋白（zinc-finger nucleases，ZFNs）和TALE核酸酶（transcription activator like effector nucleases，TALENs）技術，其具有載體構建簡便、靶位點選擇廣泛及打靶效率高等優勢，目前已成功用于水稻[11-12,15,28]、玉米[29]、小麥[30]等多種作物特定基因的定點編輯且多用于受體材料的定向遺傳改良。

圖6 qsh1純合突變系及HR1128野生型qSH1相對表達量Fig. 6 qSH1 relatively expression level of qsh1 mutant line and HR1128 WT

本研究利用雙靶點CRISPR/Cas9表達載體對水稻的qSH1進行定點編輯，成功獲得一系列不同突變類型的qsh1突變體。T0代qsh12個靶點的突變頻率分別為 54.55%和 63.64%，突變基因型以雙等位突變頻率最高（T5、T1均為42.9%），突變類型以10 bp以內小片段的堿基缺失為主（T5和T1分別為60.0%和40.0%），這與前人研究結果一致[31-32]。對T1代單株的靶位點和T-DNA元件的檢測發現在T1代植株中突變位點和T-DNA載體骨架都發生了分離，由此從T1分離群體中篩選得到不含T-DNA成分的qsh1純合突變體，并進一步自交獲得T2代qsh1突變系。同時，對 T0和 T1代轉基因陽性植株的潛在脫靶位點進行了脫靶效應的檢測分析，發現被檢測的植株均未發生脫靶現象。

圖7 qsh1純合突變系及HR1128野生型 qSH1第一個外顯子預測氨基酸序列分析Fig. 7 Analysis of qSH1 gene the first extron putative amino acid sequences of qsh1 mutant lines and HR1128 WT

通過對黃熟后的T2代qsh1純合突變系籽粒脫落拉力的測定分析，與野生型對照相比，2個突變系落粒性有顯著性降低（籽粒脫落拉力值分別為（116.38±15.48）g和（103.73±15.70）g）。發現 17SZ01和 17SZ02突變系均在qSH1的第一個外顯子上發生了堿基插入，使該基因編碼區產生移碼突變，從而導致其編碼的氨基酸改變且qSH1蛋白翻譯提前終止，最終引起該蛋白不能發揮正常的生物學功能，可能是造成突變系落粒性顯著降低的主要原因。而 17SZ01突變系的qSH1表達量發生顯著下降，是否對突變系落粒性表型的改變起到增效作用？后續仍需更多不同突變類型的純合系進行分析，以驗證推論是否正確。據報道，5′-UTR作為連接第一個外顯子和啟動子的非編碼區，該區域在基因的轉錄和翻譯過程中起著重要的調控作用，該區域的突變可直接影響啟動子活性，進而影響下游基因表達[33-35]，所以本研究分析認為17SZ01突變系在qSH1的5′-UTR區的缺失突變，可能引起了其調控位點的功能變化或喪失，影響了該基因啟動子的活性，從而導致了該突變系qSH1的表達量顯著下降。同時，由于第一個外顯子上的插入突變可能激活了植物體細胞內無義介導的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）途徑[36]及轉基因組培操作過程中可能誘發的轉座子激活等現象[37]，都可能影響mRNA的穩定性，從而造成突變系基因表達的變化。

傳統的遺傳改良育種技術周期長、效率低，且容易帶入連鎖累贅基因。CRISPR/Cas9基因編輯技術可以快速、高效地定點編輯特定基因定向改良受體材料的目標性狀，而且在自交后代中分離得到無 T-DNA成分的純合突變株系，極大地縮短了水稻遺傳改良育種的周期。本研究定點編輯了易落粒的大穗型秈稻品種HR1128中qSH1，并在得到的突變體后代中獲得了落粒性狀顯著降低的改良株系。目前，筆者正在將改良的突變系材料與野生型親本進行回交選育，進一步純化突變系后代的遺傳背景。并同時篩選更多不同突變類型的純合系，解析不同位點突變對降低落粒性的改良效果以挖掘最適的突變位點，為定向改良某些水稻品種（組合）易落粒這一復雜農藝性狀探索了一條全新、綠色、高效的分子育種途徑。

4 結論

利用 CRISPR/Cas9技術對易落粒的雜交稻親本品種HR1128的qSH1進行定點編輯，創制了一批qsh1突變體材料，并篩選獲得落粒性顯著降低的改良后代。這是一條全新、綠色、高效的分子育種策略。

致謝：pYLgRNA-U3/U6a載體及pCRISPR/Cas9表達載體由華南農業大學劉耀光院士提供；文章的撰寫及修改得到彭彥博士、潘銀林博士的幫助，在此表示感謝。