組蛋白乙酰化對衰老雌鼠胚胎發育影響的研究

徐堯

1 前言

隨著晚婚晚育政策的推行以及“二胎政策”的放開，生殖健康越來越成為人們關注的焦點。衰老的卵子會帶來包括流產在內的一系列問題，通過對衰老卵子影響因素的研究，我們可以更好地對卵子質量進行調控，提高生殖健康能力。

為進一步探索與卵母細胞質量相關的年齡的相關因素，我們在實驗室比較了年輕C57BL/6雌鼠（5周）與45周雌鼠的MII卵母細胞的mRNA的各個基因表達量。通過轉錄組測序發現，接近5%的母源物質受到了年齡增長的影響。有趣的是，有很多與表觀修飾相關的轉錄本受到了年齡增長的嚴重影響，例如DNA甲基化轉移酶、組蛋白乙酰化酶等。

我們的研究是通過比較不同年齡雌鼠的受精胚胎的發育能力發現衰老雌鼠的生殖能力出現明顯下降，并出現流產、妊娠率低等現象。該研究通過在體內和體外模擬方式明確了乙酰化升高是卵母細胞衰老造成動物流產、妊娠率低的一個重要原因，并且乙酰化的升高改變了眾多基因的表達，從而為人們提高對卵母細胞衰老認識、進行胚胎質量控制提供重要的證據。

2 方法

2.1 CD-1雌鼠受精卵的獲取

我們選取了 8～10周齡的CD-1雌鼠獲取受精卵和實驗用卵母細胞。

2.2體外TSA處理

通過對實驗受體分別做添加去乙酰化酶抑制劑TSA，和不加TSA處理，放入胚胎培養箱觀察發育。囊胚后移植至假孕體內觀察體內發育。

2.3 假孕雌鼠的制備

挑選健康8周齡左右性成熟雌性CD-1品系雌鼠，與同品系輸精管結扎公鼠合籠交配。之后通過檢栓，挑選出假孕雌鼠。

2.4 雌鼠胚胎移植

對雌鼠進行全身麻醉后，將要移植的囊胚注入假孕鼠輸卵管膨大部中。

2.5 免疫熒光染色

將要染色的胚胎，按流程進行清洗、染色。

2.2.6 PCR檢測

按配方進行PCR鑒定。

3 數據分析

3.1 衰老雌鼠生殖能力下降

3.1.1衰老雌鼠受精卵質量差

我們選取6周和14個月大的CD-1雌鼠作為研究對象。通過超數排卵的手段對兩種雌性雌鼠進行激素調節，隨后在注射完HCG后，將超數排卵的雌鼠與雄鼠進行合籠，利用輸卵管沖洗的辦法取出受精卵。通過在高倍光鏡下檢測，我們發現衰老雌鼠的受精卵胞質發黑，并呈顆粒化。該結果說明受精卵的質量隨著雌鼠年齡的增長而變差。

3.1.2衰老雌鼠早期胚胎發育效率低下

我們分別取年輕雌鼠（8周）和衰老雌鼠（14月）的受精卵進行體外培養觀察。我們發現衰老雌鼠的胚胎發育率隨著細胞分裂次數的增多，逐漸下降（圖3-1）。囊胚率約為年輕雌鼠的一半。該結果表明隨著雌鼠年齡的增長，雌鼠早期胚胎發育能力下降。

3.1.3衰老雌鼠胚胎具有妊娠率低并出現胎兒流產畸形的特點

為了更好地排除衰老個體對胚胎發育的影響，我們所選取的假孕均為同一周齡，即均為8周雌鼠。我們分別向假孕雌鼠體內移植衰老雌鼠胚胎51枚，年輕雌鼠胚胎16枚。在雌鼠孕期19.5dpc的時候，檢測胎兒出生。我們發現移植了衰老雌鼠胚胎的假孕雌鼠有兩個胎兒出生，而移植了年輕雌鼠胚胎的假孕有10只胎兒出生，衰老雌鼠胚胎嚴重降低了胎兒的出生率及妊娠率。

3.2 高組蛋白乙酰化水平是衰老雌鼠胚胎生殖異常的一個主要原因

3.2.1衰老雌鼠胚胎的乙酰化水平升高

影響衰老雌鼠胚胎發育能力低下的因素有很多。我們將研究的重點關注在基因組的表觀修飾上來。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化和組蛋白乙酰化等。通過賴氨酸乙酰化的免疫熒光染色，我們發現衰老雌鼠的乙酰化染色的熒光強度極高（圖3-2）。初步證明了衰老雌鼠的乙酰化程度增高。

3.2.2增加年輕雌鼠乙酰化程度獲得與衰老雌鼠一樣生理表型

我們嘗試在體外培養環境下，增加年輕雌鼠胚胎的乙酰化程度進行體外模擬實驗。TSA是一種去乙酰化酶抑制劑，通過向胚胎培養液中添加該試劑，可以顯著提升胚胎的乙酰化程度。隨后，我們通過向同為8周雌鼠的胚胎培養液中添加TSA來增加年輕雌鼠胚胎的乙酰化程度。

通過對到期雌鼠出生個數的比較，我們發現TSA處理后的年輕胚胎的雌鼠到期效率和年老雌鼠一致（圖3-3）。實驗結果說明，乙酰化程度升高后年輕雌鼠胚胎獲得了和年老雌鼠胚胎一致的生理表型。

3.2.3 TSA處理的年輕雌鼠胚胎具有和年老雌鼠類似的乙酰化程度

為了確定是否TSA處理后年輕雌鼠胚胎的乙酰化程度和年老雌鼠類似，我們通過免疫熒光的手段對胚胎進行染色。發現經過TSA處理后的雌鼠胚胎，具有了和年老雌鼠相類似的乙酰化程度。結果說明，乙酰化程度改變是衰老雌鼠胚胎質量變差的一個重要原因。

3.3 乙酰化程度改變導致了一些關鍵性基因表達量改變

為了探究乙酰化程度改變為什么會造成動物流產等現象，我們利用qpcr技術對年輕、年老、TSA處理的胚胎受精卵進行了基因表達量的鑒定，通過鑒定，我們發現包括Peg10在內的多個對胚胎發育到期的重要基因的表達量相對于野生型較高，并存在顯著差異（圖3-4）。因此，乙酰化程度改變很有可能是增強了多個關鍵性基因的表達，從而導致基因表達紊亂，造成了胎兒發育雌鼠問題與障礙。

4 結論

1.衰老雌鼠胚胎的乙酰化水平增高；

2.通過體外模擬發現乙酰化水平升高是造成衰老雌鼠胚胎發育能力下降的一個主要原因；

3.乙酰化程度增高，改變基因表達水平使得基因表達紊亂。

5 創新點

1.明確了乙酰化程度升高是雌鼠胚胎質量變差的一個主要原因；

2.證明了雌鼠流產問題很可能是乙酰化程度改變后造成基因表達量改變；

3.為人類胚胎質控提供一個新的質控標準。

責編/萬海濱