一株南極真菌的菌種鑒定及生長特性研究

史崇麗，繆錦來,3

( 1.青島科技大學，山東 青島266000； 2.國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266000； 3.青島大學，山東 青島266000 )

南極地區自然環境惡劣，使得動植物難以生存，因此對于南極地區的生物研究以微生物為主。南極真菌在生物物種、活性代謝產物等方面表現出明顯的多樣性和新穎性，據不完全統計，在南極大陸已發現的約251種真菌中，有至少20種為新種(約占8%)，顯示了南極真菌的新穎性和多樣性[1]。且南極真菌的次級代謝產物具有非常高的催化活性，成為醫藥研究新的重要資源[2-5]。本研究對實驗室保存的一株南極絲狀真菌，通過生態觀察、分子水平檢測、分析其rDNA序列確定了該真菌與出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)的相似度最高，為再進一步深入研究該菌種的特性及應用提供前期研究基礎。

1 材料與法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

采自南極的真菌AS，由國家海洋局第一海洋研究所海洋生物活性物質重點實驗室保存。

1.1.2 培養基

種子培養基[6]：培養基葡萄糖(8 g/L)， MgSO4(1 g/L)， K2HPO4(1 g/L)，酵母膏(2 g/L)，測得pH為6.86。斜面培養基：瓊脂(20 g/L)，其他成分同種子培養基。

1.1.3 主要試劑

RNase(Sigma)10 mg/mL；異丙醇；70%乙醇；無水乙醇；10% SDS；1X TAE(pH 8.0)；純化水(經Millipore 過濾滅菌)。

1.2 儀器與設備

5417R離心機(Eppendorf公司)；純水儀(德國默克密理博公司)；電泳儀DYY-7B(北京六一儀器廠)；凝膠成像分析儀JY04S-3E(君意電泳)；PCR儀(Thermo ARKTIK)；紫外分光光度計(島津)；電子顯微鏡ELWD 0.3/OD75(Nikon)；恒溫搖床ZQLY-180S(上海知楚儀器有限公司)；研缽；酒精燈。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株形態觀察

將保存的菌種采用劃線法或點接種法，進行菌株活化培養，在固體培養基上觀察菌株形態，在顯微鏡下觀察液體培養基的菌株形態。

1.3.2 提取基因組DNA

在酒精燈火焰旁取培養基上的菌株于研缽，液氮研磨[7]；將研磨好的菌株轉移至 1.5 mL 離心管中，標記菌株名稱，加入 0.6 mL TE(pH 8.0)，用槍頭吸打均勻，使菌體充分懸浮；加入 250 μL 10% SDS，輕輕倒轉混勻。加入 3 μL 蛋白酶 K(20 ng/μL)，輕輕混勻，37 ℃水浴 1 h。加入 150 μL 5 mol/L NaCl，輕輕混勻；加入 150 μL 2% CTAB，輕輕混勻，65 ℃水浴 20 min。12 000 r/min 常溫離心 20 min；小心吸取上清液至新的1.5 mL離心管，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫放置 30 min，12 000 r/min，4 ℃離心 10 min。吸掉上清液，在吸水紙上控干液體，加 750 μL 70%乙醇，輕彈管壁，使沉淀懸浮并反復顛倒數次，12 000 r/min，4 ℃離心 2 min；每管加入 30 μL 純化水溶解沉淀(水中加 RNase，終質量濃度 10 ng/μL)，用手輕彈管壁，4 ℃溶解過夜。

1.3.3 DNA電泳檢測

電泳條件：采用1×TAE電泳緩沖液，1%(質量分數，下同)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA模板純度。加樣量為5 μL，電泳儀電壓為120 V，電泳時間為30 min。紫外燈下檢測菌株基因組DNA提取情況。基因組DNA Marker 條帶組成:1000、2000、3000、4000、5000、6000、8000、10 000 bp。4000 bp 條帶質量濃度為 20 ng/μL，顯示為加亮帶，其余條帶質量濃度均為 10 ng/μL。PCR擴增產物Marker 條帶組成：100、250、500、750、1000、2000、3000、5000 bp。750 bp 條帶質量濃度為 20 ng/μL，顯示為加亮帶，其余條帶質量濃度均為 10 ng/μL。

1.3.4 ITS rDNA的PCR擴增

采用18S引物序列，ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[8]，對菌株進行ITS序列擴增。30 μL反應體系如下：H2O 17.8 μL，Buffer 3 μL，dNTP 2 μL，PrimerⅠ3 μL，PrimerⅡ3 μL，DNA模板 1 μL，酶 0.2 μL。循環參數：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min ，35個循環，最后72 ℃延伸10 min。

1.3.4 ITS rDNA序列測定及分析

由北京六合華大基因科技有限公司完成純化和測序工作。將測序結果登錄GenBank進行BLAST比對，選出與該序列相關性較高的核酸序列用于系統發育學分析。采用Clustal W軟件進行多序列比對分析。使用Mega 6.0軟件采用最大似然法[9]計算，構建菌株的系統發育進化樹，采用自舉分析進行置信度檢測，自舉數據集為1000次。

1.4 菌株優化培養

1.4.1 溫度篩選

將200 mL培養基裝于500 mL錐形瓶中，26 ℃培養24 h，作為菌株母種。在含有87 mL的種子培養基的錐形瓶中接種15%的菌液，并設置溫度為15、25、30 ℃，轉速為150 r/min的搖床，將接種后的培養基置于不同溫度的搖床中培養，每隔一段時間，在600 nm處測量不同溫度下的吸光值(記作OD600)，OD600作為反映菌株生長密度的指標之一。繪制不同溫度下菌株的生長曲線。

1.4.2 無機鹽離子篩選

將200 mL培養基裝于500 mL錐形瓶中，26 ℃培養24 h，作為菌株母種。在250 mL的錐形瓶中加入100 mL的種子培養基，另分別加入5 g/L的氯化鎂、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈣、氯化鐵、氯化錳及硫酸鋅離子，經高溫高壓滅菌后，接入菌種20%，將錐形瓶放在已經篩選的適宜溫度的搖床中培養，觀察菌液生長狀態，并每隔一段時間測量其OD600。

1.4.3 pH篩選

將200 mL培養基裝于500 mL錐形瓶中，在30 ℃，150 r/min中培養12 h，作為菌株母菌種。用pH計測量種子培養基的自然pH為6.86，設定pH分別為5、6、7、8、9的種子培養基，在250 mL的錐形瓶中加入100 mL的種子培養基，接菌量為20%，在30 ℃的搖床中培養，每隔一段時間，在600 nm處測量不同培養基的吸光值，繪制不同初始pH條件下的菌株生長曲線。

2 結 果

2.1 菌株AS形態鑒定結果

2.1.1 菌株在液體培養基中的生長狀態

將液體培養基中的菌液混勻，用一次性滴管將菌液涂在載玻片上，在顯微鏡下觀察，結果見圖1。可見菌株多為球型或卵圓形單個存在，直徑約2 μm，或幾個細胞連接在一起，如串珠狀，多為出芽生殖。

2.1.2 菌株在固體培養基中的生長狀態

在斜面培養基室溫(約25 ℃，下同)條件下中約12 h便可生長出橘黃色小菌落(圖2a)；圖2b為劃線接種，室溫培養約24 h，并4 ℃冰箱保存一個月的菌株AS。在固體培養基的生長初期，菌落呈中央凸起、濕潤、黏稠、可流動的黏液狀，生長中后期，菌株室溫培養一周后可觀察到菌落周邊帶有毛邊，有些出現菌絲黏連的現象。

圖1 菌株液體培養顯微形態

圖2 菌株在固體培養基的生長狀態

2.2 菌株AS分子鑒定結果

2.2.1 菌株AS ITS序列擴增結果

由圖3可見，菌株ITS序列擴增產物在約500 bp的位置有清晰條帶，且無其他雜質存在。

圖3 基因組DNA及PCR擴增產物圖片

2.2.2 同源性分析結果

選擇與菌株AS同源性較高的菌株的ITS序列進行多序列比對，構建系統進化樹(圖4)，由系統進化樹可知，菌株AS與出芽短梗霉菌同源性最高，同時結合菌株AS的形態觀察，可初步鑒定菌株AS為出芽短梗霉菌。

圖4 基于ITS序列構建的系統進化樹

2.3 菌株培養優化結果

2.3.1 培養溫度對出芽短梗霉菌AS生長的影響

出芽短梗霉菌AS在不同溫度下的生長曲線見圖5。當菌株處于對數生長期時，培養溫度越高，菌株生長的越快；當菌株處于穩定期時，30 ℃時，菌液密度最高，其次是25 ℃，15 ℃時的菌液密度最低。

圖5 出芽短梗霉菌AS在不同培養溫度下的生長曲線

2.3.2 不同無機鹽離子對出芽短梗霉菌AS的影響

培養約17 h后，出芽短梗霉菌AS處于穩定生長期，此時添加CaCl2的培養基OD600值最大，添加ZnSO4的培養基OD600值基本無變化，出芽短梗霉菌AS培養狀態見表1。

表1 不同無機鹽離子對菌株生長的影響

2.3.3 培養基初始pH對出芽短梗霉菌AS的影響

出芽短梗霉菌AS在不同pH條件下的的生長曲線見圖7。可以看出該菌株在弱酸性和弱堿性的條件下對數生長期和穩定期生長趨勢相同，具有較好的適應性。

圖6 出芽短梗霉菌比在不同初始pH下的生長曲線

3 討 論

3.1 菌株鑒定定結果分析

本試驗以南極真菌AS為研究對象，利用傳統的形態分類學方法[6-8]對菌株AS進行鑒定，經菌株生長觀察可以看出，菌株AS具有多形態細胞，如酵母狀細胞、梗狀菌絲體細胞[9]。經分子生物學分析結果初步確定，真菌AS為出芽短梗霉菌。

短梗霉，在分類學上屬于短梗霉屬，在酵母菌分類中屬于酵母菌的一個屬，是多細胞形態的類酵母真菌[10]。其生存能力極強，適應自然環境的各個角落，如淡水、海水、森林生態系統、動植物組織等，并多棲息于多種極端環境[11]。短梗霉具有種類的多樣性，研究者將短梗霉分為3個種，包括5個變種[12]。目前已有對短梗霉菌的生長條件、代謝產物的研究[9,13-14]。

3.2 出芽短梗霉菌AS生長特性分析

采用單因素試驗對出芽短梗霉菌AS的生長條件進行優化，設定15、25、30 ℃ 3個不同溫度，通過控制試驗變量，測量隨溫度和時間的改變，菌液密度的變化，初步確定，溫度為30 ℃時出芽短梗霉菌AS生長速度較快。試驗在選定適宜生長溫度的基礎上，經多次測量OD600發現，出芽短梗霉菌AS生長約17 h，吸光值不再改變，說明此時的出芽短梗霉菌AS生長處于穩定期；此時添加Mg2+和Ca2+的菌液在600 nm處的吸光值明顯高于其他無機鹽離子，說明這兩種無機鹽離子較其他無機鹽離子而言，更有利于出芽短梗霉菌AS生長；通過觀察在不同無機鹽中的出芽短梗霉菌AS生長狀態發現，培養基澄清或產生沉淀，均不利于出芽短梗霉菌AS生長。 對出芽短梗霉菌AS生長最適pH進行探究，試驗表明pH 5～9時，菌種的生長狀態無太大差異，表明出芽短梗霉菌AS對不同pH的適應性較強。

本研究主要對一株生命力極強的南極真菌進行鑒定，并初步探究了其生長條件，以期在為合成與生存環境相關的功能性生物分子如表面活性劑、普魯蘭多糖、海藻糖、納米顆粒、及其他生物活性物質等奠定基礎。王帥等[15]對本實驗室保存的一株南極酵母進行培養，并對海藻糖的提取工藝進行優化；周鮮嬌等[16]對一株海洋紅酵母(Rhodotorula)進行鑒定并對其培養基做了優化處理；安鑫龍等[17]對海洋微生物在海洋污染治理中的應用現狀進行了分析；這些試驗均說明了在極端海洋環境下生存的微生物，具有極強的生命力，且具有廣闊的應用前景[18]。