鎘離子對文蛤鰓上皮細胞超微結構的影響

甄靜靜，葉方源，王 都，倪小英，應雪萍

( 溫州大學 生命與環境科學學院，浙江 溫州，325027 )

隨著沿海經濟的快速發展和海洋資源的快速開發，近岸海域受重金屬污染越來越嚴重[1-2]。在海洋環境中，有毒金屬在沉積物和海洋生物中積累，然后通過食物網轉移到人類。因此，海洋生物中重金屬含量的檢測和評估變得越來越重要[2]。鎘為非降解型有毒物質，易被生物富集并有生物放大效應， 嚴重威脅人類和水生生物的生存[1]。重金屬鎘可通過兩種途徑進入生物體內，一是通過鰓吸收水體中的鎘離子再由血液循環運送至動物體內各個部位；二是在攝食過程中經由消化道進入動物體內[3]。溶解的及顆粒狀的金屬可通過跨膜通道或細胞內吞作用進入溶酶體或囊泡，隨后通過血液排泄或運輸[4]。有研究表明，鰓長時間與流動水體接觸，相比其他器官更易受到重金屬的污染，已被鑒定為雙殼類動物重金屬積累的主要器官[4-6]。重金屬可通過干擾鰓上皮細胞的離子運輸進入鰓組織，從而損壞鰓的滲透壓調節和呼吸功能[7]。翡翠貽貝(Pernaviridis)[8]主要通過鰓器官來富集污染物，故研究鰓的超微結構有助于了解污染物富集規律。鎘離子導致中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)鰓葉增厚、血腔增大、上皮層破壞、線粒體膨脹直至解體，直接影響鰓組織的能量代謝、離子主動轉運機制及滲透壓調節能力[9]。

雙殼類動物的鰓是重金屬富集的主要靶器官之一[4-6]，能最初反應出重金屬對機體的損害，其組織病理學的改變常被用作檢測水生生物健康和水環境中重金屬污染的有效和靈敏的標志物之一[2,6-7,10]。此外，雙殼類動物因其埋棲的生活方式、廣泛的地理分布、種群密度高且易于積累污染物等特點，被廣泛應用于實驗室或野外的重金屬生物累積效應試驗[4-7]。文蛤(Meretrixmeretrix)主要生活在潮間帶泥沙中，采用濾食的攝食方式，移動性較低，易受重金屬污染，故常被用作重金屬污染的指示生物[11-12]。

鎘會破壞鰓的結構，且對其呼吸功能及滲透功能產生影響[1,13]。目前關于鎘對文蛤的研究主要集中在急性毒性[14]、肝胰腺超微結構的影響[15]及生理生化指標影響[16-18]，未見鎘對鰓上皮細胞超微結構影響的報道。筆者通過不同劑量的鎘離子對文蛤的短期染毒作用，利用透射電鏡對其鰓上皮細胞的超薄切片進行觀察，研究不同質量濃度Cd2+對文蛤鰓上皮細胞超微結構的影響，進一步探究Cd2+在雙殼類動物鰓中的積累和急性毒性效應。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用文蛤于2015年7月購自溫州靈昆貝類養殖場。化學純氯化鎘購自上海天蓮精細化工有限公司，將其配制成120 mg/L母液，根據試驗需要，用鹽度15的人工海水稀釋成不同質量濃度的Cd2+溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 體外鎘暴露法染毒與處理

根據文蛤96 h的半致死質量濃度(15.01 mg/L)[15]的10%、20%、40%、80%設置4個染毒劑量，分別為1.5、3、6、12 mg/L，同時設對照組。每個質量濃度設3組平行樣，每組選取體型相近、活動正常、生長狀況良好的文蛤10枚，在室溫20 ℃、pH 8的環境中進行養殖，每24 h換水一次，期間不投餌，染毒時間為5 d。

1.2.2 超薄切片制作與觀察

染毒結束后，解剖文蛤并迅速取出鰓，切成1 mm3小塊，在2.5%戊二醛固定液中于4 ℃冰箱內固定2 h以上。0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液漂洗3次后，1%鋨酸固定。之后用磷酸鹽緩沖液漂洗3次，蒸餾水漂洗2次。再用1%醋酸鈾染色，丙酮梯度脫水，Epon 812環氧樹脂包埋、聚合。1%醋酸鈾染色，丙酮梯度脫水，環氧樹脂包埋，LKB-2088型超薄切片機切片，醋酸鈾—檸檬酸鉛雙重染色后，日立-7500透射電鏡觀察并拍照。

2 結 果

2.1 對照組文蛤鰓上皮細胞超微結構

對照組文蛤鰓上皮細胞核呈圓形或橢圓狀，核膜完整，核內物質清晰可見(圖1a)。線粒體呈橢圓形，排列規則，大部分線粒體嵴結構完整(圖1b～d)。微絨毛分布在細胞表面，排列緊密，無空泡化現象(圖1b～d)。細胞膜完整、界限清晰、細胞排列緊密(圖1c～d)。

2.2 1.5 mg/L Cd2+染毒組文蛤鰓上皮細胞超微結構

在1.5 mg/L Cd2+染毒組中，鰓上皮細胞核結構基本完整，呈橢圓形，少數細胞的核出現輕微的變形，核膜有輕度的囊泡化現象(圖1e～f)。微絨毛排列齊整，大部分未出現分解情況(圖1e)。線粒體排列整齊，嵴結構清晰，但有少部分嵴發生斷裂現象(圖1f,g)，且有少部分線粒體形狀發生變形，內部出現空泡狀(圖1h)。上皮細胞中開始出現溶酶體，但體積較小，僅含極少量的沉積物(圖1f,h)。

2.3 3 mg/L Cd2+染毒組文蛤鰓上皮細胞超微結構

在3 mg/L Cd2+染毒組中，鰓上皮細胞核內物質逐漸開始解體(圖1i)。核膜囊泡化現象較嚴重(圖1j,k)。微絨毛有脫落現象，排列較松散(圖1i,j,l)。線粒體數量稍有增加，體積有所增大，部分線粒體中嵴解體較嚴重(圖1j,k)。細胞中溶酶體數量與低質量濃度染毒組相比有所增加，且體積開始增大，溶酶體中的沉積物不斷增多(圖1l)。

2.4 6 mg/L Cd2+染毒組文蛤鰓上皮細胞超微結構

在6 mg/L Cd2+染毒組中，鰓上皮細胞微絨毛進一步解體，并出現大量脫落現象(圖2a)。線粒體腫脹現象明顯，形狀不規則，嵴進一步解體(圖2a,b)。溶酶體數量增加，內部沉淀物明顯增多(圖2a,b)。細胞核形狀嚴重變形，核膜多處內陷，且核膜囊泡化現象越來越嚴重(圖2c)。

2.5 12 mg/L Cd2+染毒組文蛤鰓上皮細胞超微結構

在12 mg/L Cd2+染毒組中，鰓上皮細胞中線粒體排列混亂，形狀變形，大部分線粒體嵴發生斷裂，空泡化程度越來越嚴重(圖2d)。細胞核嚴重變形，核膜解體破裂，核內物質溢出(圖2e)。溶酶體的數量增加，沉積物增多(圖2f)。微絨毛大量脫落，出現嚴重的空泡化現象，細胞器基本泡狀化(圖2d,f)。

3 討 論

鎘是一種有毒的重金屬，它能誘導動物產生氧化損傷，影響生物的組織結構，從而引起嚴重的退行性病變[1,14-18]。近年來，人們已逐漸認識到基于化學分析的環境重金屬污染風險評估不能清晰、直觀地表明污染物對水生生物的毒性作用[5]。已知亞致死水平的重金屬會影響細胞的結構，進而導致許多海洋生物的重要功能受損，因此用細胞超微結構變化來預測環境中重金屬污染的手段越來越受到人們的重視[5-7,15,19]。鎘主要積累在腎、肝、鰓3個靶器官中，其中，鰓是至少能螯合或解除鎘作用的重要器官[10]。鰓由各種柱狀上皮、鱗狀細胞和黏液細胞組成，是貝類與水體進行氣體交換、排泄、滲透壓調節、過濾食物、保護層的形成和上皮表面潤滑等作用的主要器官[7]。鰓結構的受損，會影響生物體的呼吸和進食，破壞生物體內離子平衡，嚴重時甚至導致生物體的死亡[1,6,20-21]。本研究發現，即使是短期暴露于不同質量濃度的Cd2+也會導致鰓上皮細胞結構的損傷，其損傷程度與Cd2+暴露質量濃度成正相關，主要體現在細胞核、線粒體等主要細胞器及微絨毛等的影響，這與已有的研究結果相似[1,4,6,15,19-20 ]。Wang等[22]的研究也表明，隨著Cd2+質量濃度的升高和染毒時間的延長，河南華溪

圖1 0、1.5、3 mg/L Cd2+文蛤鰓上皮細胞超微結構 a～d為對照組鰓上皮細胞； e～h為1.5 mg/L Cd2+染毒組鰓上皮細胞； i～l為3 mg/L Cd2+染毒組鰓上皮細胞. a: 結構完整的細胞核(比列尺=2 μm)；b: 結構完整的線粒體和微絨毛(比列尺=0.5 μm)； c: 示細胞緊密排列(比列尺=1 μm)； d: 微絨毛和細胞結構(比列尺=1 μm)； e: 緊密排列微絨毛及稍變形的細胞核(比列尺=1 μm)；f: 溶酶體和線粒體(比列尺=0.5 μm)； g: 線粒體(比列尺=0.5 μm)；h: 溶酶體和輕度空泡化的線粒體(比列尺=0.5 μm)； i: 核物質流失的細胞核(比列尺=2 μm)；j: 部分微絨毛解體，核膜腫脹(比列尺=0.5 μm)； k: 線粒體內嵴解體(比列尺=0.2 μm)；l: 溶酶體的數量增多，體積增大(比列尺=0.5 μm). Ly.溶酶體； M.線粒體； Mc.線粒體嵴； Mv.微絨毛； N.細胞核.

圖2 6、12 mg/L Cd2+文蛤鰓上皮細胞超微結構a: 6 mg/L Cd2+組，示微絨毛的進一步解體(比列尺=0.5 μm)；b: 6 mg/L Cd2+組，示溶酶體(比列尺=0.5 μm)；c: 6 mg/L Cd2+組，示細胞核變形、核膜泡化(比列尺=0.5 μm)；d: 12 mg/L Cd2+組，示線粒體和微絨毛的解體、變形(比列尺=0.5 μm)；e: 12 mg/L Cd2+組，示嚴重變形的細胞核(比列尺=0.2 μm)；f: 12 mg/L Cd2+組，示溶酶體(比列尺=0.5 μm). Ly.溶酶體； M.線粒體； Mc.線粒體嵴； Mv.微絨毛； N.細胞核.

蟹(Sinopotamonhenanense)鰓的結構受損程度加劇，有明顯的時間—含量—效應關系。但Cd2+導致文蛤鰓上皮細胞損傷的機理有待于進一步從生理、生化及分子生物學方面深入研究。

Domouhtsidou等[7]的研究認為，雙殼類動物對金屬離子的吸附和毒性作用機制應與溶酶體的功能緊密相連。本研究發現，隨著Cd2+質量濃度的上升，文蛤鰓上皮細胞中溶酶體的數量和大小都在增加，溶酶體內部的沉淀物顏色加深，可能是重金屬處理后水解酶的活性增加，也可能是一種防御反應機制，以補償重金屬暴露后細胞代謝的紊亂。這在美洲牡蠣(Crassostreavirginica)[23]的鰓中也得到了類似的結論，即Cd2+在溶酶體內聚集，溶酶體對重金屬積累會產生不溶性顆粒，之后通過滯留或者細胞分泌從而解毒。因此，將積累的Cd2+輸送到溶酶體，通過解毒功能減輕潛在的毒性。Giarratano等[24]研究發現，在許多海洋生物的組織細胞內有溶酶體—液泡系形成的有膜包被的高含量重金屬顆粒，能起到積累解毒的作用，其中包括鐵、銅、鉛、鋅等重金屬。Sokolova等[23]發現，細胞內線粒體的數量會隨著重金屬染毒質量濃度的升高而增加，并認為可能是為了補償重金屬毒性對生物體結構功能造成影響從而導致的呼吸作用的抑制。本研究發現，Cd2+低質量濃度時文蛤鰓上皮細胞中少數線粒體內嵴斷裂現象，線粒體形狀尚顯規則，隨著Cd2+染毒質量濃度的升高，線粒體體積變大，形狀變形，大多數嵴逐漸脫落，腫脹和空泡化現象普遍，并出現少量的凝聚現象，但未發現像泥蚶(Tegillarcagranosa)[1]及美洲牡蠣[23]細胞中線粒體數量增多的現象。有研究表明，線粒體的凝聚或腫脹被認為是對動物細胞中重金屬毒性的一種病理反應[1,6-7,15,23]。Green等[25]研究表明，細胞結構功能的破壞可能導致有毒物質在線粒體內積累，影響線粒體的基本功能，導致細胞因能量障礙而凋亡。因此，線粒體損傷在細胞凋亡中也發揮關鍵作用[17,22,25]。

研究表明，鰓表面的微絨毛能增大上皮細胞表面積，有利于鰓的呼吸和離子轉運的作用[6-7,21,26]。本研究發現，隨著Cd2+染毒質量濃度的升高，鰓絲微絨毛由原來數量眾多、整齊排列的結構逐漸演變成數量減少甚至大量脫落的現象。文蛤鰓絲微絨毛數量的下降可能因為文蛤對重金屬的吸收后導致細胞結構破壞，也意味著器官正常的功能可能出現紊亂，包括水過濾不足，氣體交換不足和濾食減少等，這與已有的研究結果一致[1,5,26 ]。Sunila[26]研究重金屬離子對紫貽貝(Mytilusedulis)的影響時也發現，在重金屬離子作用下，紫貽貝鰓上皮細胞腫脹變形，微絨毛空泡化且大量脫落，并認為細胞結構的這些變化可能是一種防御機制。鰓絲微絨毛主要存在于鰓組織的黏液細胞和分泌細胞表面，這些細胞作為重金屬結合的一個位點，在重金屬進入組織前進行捕捉作用，或通過分泌細胞或其他細胞驅逐已吸收的污染物[5,7]。隨著動物長期暴露于重金屬中，鰓絲形態結構的變化，如上皮細胞的逐漸壞死、脫落和黏液分泌增加、線粒體空泡化等將反映其分子水平上的紊亂，因此識別這些結構的變化將有助于了解動物對金屬接觸后的早期細胞反應的結果。