異育銀鯽源嗜水氣單胞菌對磺胺類耐藥性分析

喬 毅，沈 輝，萬夕和，王李寶，史文軍，黎 慧，蔣 葛，范賢平，張建明

( 1.江蘇省海洋水產研究所，江蘇 南通 226007； 2.江蘇省海洋漁業指揮部，江蘇 南通 226006 )

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是中國科學院水生生物研究所的魚類育種專家于1976—1981年成功選育的一種鯽魚養殖新種，因其具有生長快、個體大、抗逆性強等優點，成為我國重要的淡水水產養殖魚類。近些年，隨著異育銀鯽養殖技術的成熟，養殖戶不斷提高放養密度，投喂高蛋白優質餌料，獲得較好的經濟效益。但是在追求高產的同時，異育銀鯽的病害頻頻爆發，鰓出血病[1-3]、黏孢子蟲病[4]和常見細菌病害[5-7]給該產業造成巨大的損失，嚴重制約異育銀鯽養殖業的健康發展。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬弧菌科，氣單胞菌屬，廣泛分布于自然界的各種水體中，是多種水生動物的原發性致病菌[8-9]，為條件致病菌，也是典型的人—獸—漁共患病病原菌[10]。目前在淡水養殖過程中，大多數品種均有嗜水氣單胞菌引起病害的報道，其主要癥狀是爆發性出血，由于嗜水氣單胞菌的血清型較多，所以感染不同對象表現的癥狀各異。目前，以抗菌藥物治療水生動物細菌性病害是水產養殖過程中最常用的方法，由于抗菌藥物的長時間亂用和濫用，水產病原菌在應對藥物反復刺激的壓力下形成的耐藥性日趨嚴重，使得水產源病原菌引起的疾病藥物治療效果越來越差。磺胺類藥物因其具有抗菌譜廣、性質穩定、吸收迅速、使用方便和價格低廉等優點，是水產養殖常見的抗菌藥物之一，磺胺類藥物通過阻礙細菌RNA的合成達到抑菌作用，可防治多種水產病原菌，而臨床中的不合理使用，使得該類藥物的耐藥性日益突顯。

江蘇省蘇北地區異育銀鯽養殖面積超過六萬公頃，近些年病害引起該地區異育銀鯽的損失高達十余億元。2015年，本課題研究團隊從鹽城市大豐地區異育銀鯽病樣中篩選致病菌株，經鑒定其中嗜水氣單胞菌36株。筆者以分離純化的嗜水氣單胞菌為對象，分析菌株對磺胺類藥物的敏感性，同時對菌株攜帶的磺胺類耐藥基因進行PCR擴增，旨在為臨床用藥以及嗜水氣單胞菌對磺胺類藥物產生耐藥的機制作一定參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

36株嗜水氣單胞菌株，為2015年3—9月大豐發病異育銀鯽體內分離得到，依次編號為1、2、3、……、36；嗜水氣單胞菌標準菌株ATCC7966購自蘇州達麥迪生物醫學科技有限公司；大腸桿菌(Escherichiacoli)標準菌株ATCC25922購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 主要試劑

磺胺嘧啶(CAS：68-35-9)、磺胺甲噁唑(CAS：723-46-6)、磺胺異噁唑(CAS：127-69-5)、磺胺二甲基嘧啶(CAS：57-68-1)標準品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.5麥氏單位比濁管和水解酪蛋白瓊脂培養基購自杭州濱和微生物試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、質粒小提試劑盒(離心柱型)購自天根生化科技(北京)有限公司；Agarose B、Low EEO、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、DEPC水購自生工生物工程(上海)股份有限公司；大腸桿菌DH5α感受態細胞、Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)、T-Vector pMDTM19 (Simple)、Ribonuclease A (RNase A)等分子生物試劑購自寶生物工程 (大連) 有限公司；藥敏紙片自制，含量均為300 μg/片；其他化學試劑均為分析純。

1.3 菌株藥物敏感性試驗

在無菌條件下，接種低溫凍存的菌株在LB瓊脂培養基上復蘇細菌。根據美國臨床實驗室標準化委員會推薦的K-B紙片擴散法，挑取純培養菌落，懸于3 mL的無菌生理鹽水試管中，混勻后調整濁度與0.5麥氏單位比濁管一致。用無菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布整個水解酪蛋白瓊脂培養基表面。待平板上的水分被瓊脂完全吸收后，用無菌鑷子取藥敏紙片貼在平板表面，紙片貼上后不可再拿起，用鑷子輕壓紙片中央，保證紙片與瓊脂表面緊密貼合，每張紙片中心間距不少于24 mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15 mm，在細菌接種后15 min內貼完紙片。將平板倒置，28 ℃培養18～20 h，用游標卡尺準確測量抑菌圈直徑。參照標準判讀結果(表1)。每批藥敏試驗必須用大腸桿菌ATCC25922做質控。只有當質控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內，其他菌株的結果才可以報告。

1.4 Sul基因擴增及分析

按照天根試劑盒操作說明分別提取嗜水氣單胞菌基因組DNA和質粒DNA，經RNase A酶去除DNA制備過程中的RNA，-20 ℃保存備用。磺胺類藥物耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3引物參照文獻[11]的報道(表2)。引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成。分別以嗜水氣單胞菌基因組DNA和質粒DNA為模板，常規PCR擴增磺胺類耐藥基因Sul1、Sul2和Sul3。擴增采用50 μL體系，包括25 μL Premix Taq酶，上、下游引物各2 μL，DEPC處理水19 μL，模板2 μL。3個基因的擴增程序一致：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環，72 ℃終延伸7 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對出現與目的片段大小相符的條帶進行切膠回收，回收產物按操作說明與pMDTM19 載體連接后導入工程菌DH5α 中構建重組質粒，提取重組質粒DNA用相應基因引物進行擴增，擴增陽性的質粒外送測序。序列結果利用DNAMAN軟件進行序列間相似性分析，再通過美國國立生物技術信息中心基因庫中Blast比對，并利用Clustal X 3.0和Mega 6.0軟件構建耐藥基因系統發育樹。

表1 嗜水氣單胞菌抑菌圈直徑解釋標準

2 結 果

2.1 藥物敏感性試驗結果

采用紙片擴散法和肉湯稀釋法測定36株異育銀鯽源嗜水氣單胞菌對4種磺胺類藥物敏感性，參照美國臨床和實驗室標準協會標準，以紙片周圍形成的抑菌圈大小作為評價嗜水氣單胞菌藥物敏感性的主要依據，結合描述的方法，在進行藥物敏感性的最終判定時，對紙片法顯示為中介而最小抑菌質量濃度值較大的菌株判定為耐藥，對抑菌圈遠大于標準而最小抑菌質量濃度值偏大的菌株判定為敏感。其藥物敏感性結果見表3。

表2 磺胺類耐藥基因擴增引物

表3 嗜水氣單胞菌藥物敏感性試驗結果

注：R，耐藥；I，中介；S，敏感；MIC，最小抑菌質量濃度.

統計發現，36株嗜水氣單胞菌對磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺異噁唑和磺胺甲噁唑的耐藥率分別為83.34%、72.22%、66.66%和69.45%，其具體耐藥菌株號見表4。

表4 嗜水氣單胞菌對磺胺類藥物的耐藥率、中介率和敏感率

2.2 耐藥基因擴增結果

本研究通過常規PCR方法對36株異育銀鯽源嗜水氣單胞菌磺胺類藥物耐藥基因進行擴增，其電泳結果見圖1～圖6，其中Sul1耐藥基因在細菌染色體中檢測為陽性的有11株，質粒中陽性的有10株；Sul2耐藥基因在細菌染色體中檢測為陽性的有30株，質粒中陽性的有33株；Sul3耐藥基因在36株菌的染色體和質粒中均未檢出。

圖1 染色體Sul1耐藥基因電泳結果

圖2 質粒Sul1耐藥基因電泳結果

圖3 染色體Sul2耐藥基因電泳結果

圖4 質粒Sul2耐藥基因電泳結果

圖5 染色體Sul3耐藥基因電泳結果

圖6 質粒Sul3耐藥基因電泳結果

分別統計對4種磺胺類藥物耐藥的嗜水氣單胞菌中耐藥基因的攜帶情況(表6)，Sul1耐藥基因在4種藥物耐藥菌的染色體和質粒上攜帶率顯著；Sul2耐藥基因在4種藥物耐藥菌的染色體上攜帶率為83.33%～88.00%，在質粒上攜帶率為91.67%～93.33%。

2.3 基因克隆及分析

耐藥基因電泳結果除具有目的片段大小的條帶外還有其他非特異擴增(圖1～圖4)，本研究將目的片段大小的條帶進行切膠回收，通過克隆后外送測序。序列大小與預期結果基本相符，通過DNAMAN軟件分別對Sul1和Sul2基因片段進行多序列比對分析，結果顯示序列一致性為100%。將序列輸入美國國立生物技術信息中心數據庫中進行Blast同源性比對，結果顯示，Sul1和Sul2基因序列分別與數據庫中多個基因片段同源性達到100%。

在GenBank分別下載多個Sul1和Sul2基因，通過Mega 6.0構建系統發育樹。結果顯示，本研究中的嗜水氣單胞菌磺胺類藥物耐藥基因Sul1與不動桿菌屬(Acinetobacter，登錄號：EU375649.1)的Sul1基因聚為一支(圖7)；Sul2耐藥基因與假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas，登錄號：EF492006.1)的Sul2基因聚為一支(圖8)。

表5 嗜水氣單胞菌耐藥基因檢測結果

注：“+”示結果陽性，但條帶較弱；“++”示結果陽性，條帶較亮；“-”示結果陰性.

表6 磺胺類藥物耐藥嗜水氣單胞菌染色體和質粒上耐藥基因的攜帶率

圖7 嗜水氣單胞菌Sul1耐藥基因系統發育樹

圖8 嗜水氣單胞菌Sul2耐藥基因系統發育樹

3 討 論

采用紙片擴散法和最小抑菌質量濃度法測試了36株異育銀鯽源嗜水氣單胞菌對4種磺胺類藥物的敏感性，2種方法的試驗結果并不完全一致，為了能準確反映細菌的藥物敏感性，結果參考文獻[12]的方法進行判定，以紙片擴散法抑菌圈的大小作為主要依據，輔以最小抑菌質量濃度評價藥物敏感性，對于紙片法中介，最小抑菌質量濃度值較大的菌株判定為耐藥，對于抑菌圈遠大于標準而最小抑菌質量濃度值偏大的菌株判定敏感。試驗中最小抑菌質量濃度法的肉湯中磺胺類藥物配制的最高質量濃度為512 μg/mL，當最高質量濃度的試管中依然有細菌生長時最小抑菌質量濃度值記為>512 μg/mL。最終試驗結果表明36株菌對磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噁唑和磺胺異噁唑耐藥率依次為83.34%、72.22%、66.66%和69.45%，這與彭彬等[13-16]的研究結論相似，由此可見，水產養殖源嗜水氣單胞菌對磺胺類藥物的耐性達到非常嚴重的水平。

對磺胺類藥物敏感的細菌不能直接利用周圍環境中的葉酸，只能利用氨苯甲酸和二氫蝶啶在細菌體內經二氫葉酸合成酶的催化合成二氫葉酸，再經過二氫葉酸還原酶的作用形成四氫葉酸。四氫葉酸的活化型是一碳單位的傳遞體，在嘌呤和嘧啶核苷酸形成過程中起著重要的傳遞作用。磺胺類藥物的結構跟氨苯甲酸相似，因而可與氨苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶，阻礙二氫葉酸的合成，從而影響核酸的合成，抑制細菌的生長繁殖。細菌額外獲得二氫葉酸合成酶(Sul基因編碼)和二氫葉酸還原酶(dfrA基因編碼)編碼基因，降低了磺胺類藥物對二氫葉酸合成酶的競爭力，同時補充了二氫葉酸還原酶，削弱磺胺類藥物增效劑(如甲氧芐啶等)的作用，導致細菌對磺胺類藥物出現耐藥[17]。其中Sul基因在細菌對磺胺類藥物耐藥過程中起主要作用，目前認為Sul基因可以分為3個亞型，分別為Sul1[18]、Sul2[19]和Sul3[20]，其中Sul1基因由Ⅰ類整合子介導，可在不同菌株間水平傳播，Sul2基因既可存在大的質粒上又可由染色體介導，Sul3是Perreten等[20]在大腸桿菌中新發現的一個Sul基因。本研究中在36株嗜水氣單胞菌的染色體和質粒中均檢測到Sul1和Sul2基因，Sul1基因在染色體和質粒中的檢出率分別為30.56%和25.64%，Sul2基因在染色體和質粒中的檢出率分別為83.33%和91.67%，Sul3基因在染色體和質粒中均未檢出,并且在對4種磺胺類藥物耐藥嗜水氣單胞菌染色體和質粒中都有較高的攜帶率，可見Sul1和Sul2耐藥基因與36株異育銀鯽源嗜水氣單胞菌磺胺類藥物耐藥性存在相關性，其中Sul2可能是介導耐藥的重要基因。該結果與羊云飛等[21]的研究較為相似，賴海梅等[22]在肉雞沙門氏菌(Salmonella)中檢測到Sul1、Sul2和Sul3的陽性率分別為40%、100%和63.3%，認為Sul2是主要的磺胺類耐藥基因，而與Antunes等[23-25]Sul1為磺胺類藥物的主要耐藥基因的研究結果存在差異。Huerta等[26-27]研究認為耐藥基因的產生很有可能是多因子共同影響的結果，Ji等[28]就發現Sul1和Sul3與重金屬Cu、Zn和Hg存在顯著正相關，本研究的對象、時間和空間的差異可能是導致與其他學者研究結果不同的因素。Hoa等[29]研究表明，大多數Sul基因位于染色體基因上，本研究對嗜水氣單胞菌磺胺類耐藥基因在染色體DNA和質粒DNA上分布情況做了簡單統計，結果發現Sul基因在嗜水氣單胞菌的染色體和質粒DNA上分布差異不顯著，這與王娜[30]的研究結論一致。磺胺類耐藥性與耐藥基因及其分布關系復雜，是開展深入研究的一個重要方向。

通過對36株異育銀鯽源嗜水氣單胞菌磺胺類藥物的敏感性研究，發現該類細菌對磺胺類藥物的抗性較強，對該類細菌引起的水生動物病害控制形成一定難度。同時，嗜水氣單胞菌是一種人—獸—漁共患病菌，這對人類公共衛生、食品安全和生態環境構成嚴重威脅。另外，耐藥基因能夠通過質粒和轉座子等可移動元件上在同種或不同種細菌間水平傳播，因此，關于該地區異育銀鯽源嗜水氣單胞菌耐藥基因的研究應該受到廣泛關注。