一種中草藥復方和11種單方的體外抑菌效果及對大菱鲆腸道菌群的影響

刁 菁，李 樂，葉海斌，于曉清，樊 英，王曉璐，蓋春蕾，李天保

( 山東省海洋生物研究院，山東省海水養殖病害防治重點實驗室，山東 青島 266104 )

我國魚類養殖正逐步走向工業化養殖道路，隨著魚類養殖的集約化程度不斷提升，養殖規模不斷擴大，密度不斷增加，魚類病害頻繁發生[1-2]。水產藥物在水產動物病害防治中占有重[3]。目前，我國所使用的水產藥物主要有殺蟲劑、消毒劑、水質改良劑、抗生素、中草藥5類，其中抗生素等化學藥品的大量使用不僅會造成水產品藥物殘留，危害人類健康，同時也產生微生物耐藥及水環境污染等問題[4-6]。因此，尋找一種預防魚類疾病的綠色藥物具有十分重要的價值與意義。

中草藥作為天然藥物在防治水產動物疾病方面有著悠久的歷史，其具有毒副作用小、殘留少、抗藥性不明顯等優點，在防治疾病中除了兼有藥性，還可以通過對水產動物的營養作用、免疫增強作用及激素樣作用等發揮預防及治療的目的[7-8]。目前，中草藥對褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)、鯉魚(Cyprinuscarpio)等養殖魚類生長和免疫的影響已見報道，王吉橋等[9-10]發現中草藥配方和添加劑量是促進魚類生長和增強其免疫效果的重要因素。腸炎是養殖魚類常發的腸道性疾病，其主要原因是一些致病性細菌在魚體消化道內定殖與繁殖，進而破壞魚體消化道內的微生態系統從而引起疾病發生，嚴重時可造成魚類大量死亡，目前報道可引起魚類腸炎的細菌主要有嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)及某些弧菌(Vibrio)種類[11-14]。Nayak等[15-17]發現魚體消化道內的微生物菌群和魚類的營養與健康存在密切關聯，其菌群結構與數量的改變會直接影響魚體生理功能的正常發揮，并與疾病的發生存在聯系。中草藥常通過飼料添加的方式投喂給魚體，消化道是其直接作用部位，然而目前有關中草藥對魚類腸炎防治效果及其對魚體腸道菌群影響的研究較少，這將直接影響研篩防治魚類腸炎的中草藥復方制劑。

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)是我國北方海水養殖經濟魚類的重要代表品種。筆者基于中草藥藥物功效與配伍原則，研制出一種中草藥復方制劑，體外試驗分析其對多種水產病原菌的抑制效果，并通過投喂試驗檢測其對患腸炎大菱鲆的治療效果，同時運用高通量測序技術對比分析投喂中草藥對患腸炎病的大菱鲆腸道菌群的影響，研究結果將為養殖魚類消化道類疾病的預防與控制提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中草藥

中草藥復方YCJ配方由山東省海水養殖病害防控重點實驗室根據中草藥抑菌特性、藥物功效和配伍原則研發，中草藥原藥均購自青島醫保城。

1.1.2 供試菌株

哈維氏弧菌(V.harveyi)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、魯菲不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)、遲鈍愛德華氏菌、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)，均由山東省海水養殖病害防控重點實驗室分離獲得；副溶血弧菌(V.Parahaemolyticus)、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 試驗魚

試驗用患腸炎病大菱鲆由煙臺龍口宏威海洋食品有限公司提供，體長(18±1) cm，養殖水溫(14±2) ℃。

1.2 方法

1.2.1 中草藥水提液與粉劑的制備

將中草藥復方制劑YCJ及配方中11種抗菌中草藥單方(黃柏、金銀花、敗醬草、五倍子、白頭翁、石榴皮、白花蛇舌草、半枝蓮、馬齒莧、紅藤、黃連)，分別置于50 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒等質量；稱取中草藥單方及復方各50 g，分別按1∶10比例加入蒸餾水浸泡30 min；置于電磁爐上煎煮，煮沸后用文火煎煮30 min，然后用4層紗布過濾，過濾后的中草藥繼續添水煎煮，重復2次；最后將濾液合并繼續煎煮濃縮至50 mL，使藥液中生藥質量濃度為1 g/mL，高壓滅菌后4 ℃保存備用。

中草藥復方制劑YCJ微粉由山東亞康藥業股份有限公司加工制備，粉碎粒度為80%，通過200目篩，并置于陰涼干燥處保存備用。

1.2.2 中草藥水提液體外抑菌試驗

將待測11種細菌分別接種于MH 肉湯中增菌，28 ℃培養過夜后，離心收集菌體用生理鹽水重懸并調整密度至含菌量約1.5×108個/mL，然后分別涂布于MH瓊脂平板，每板100 μL菌液。每個平板中放置3個滅菌后的牛津杯，牛津杯內加入中草藥水提液100 μL。28 ℃恒溫培養箱內培養24 h后，測量抑菌圈大小，計算平均值。

1.2.3 中草藥復方制劑YCJ對大菱鲆腸道菌群影響的檢測

投喂試驗：患腸炎病大菱鲆肛門發紅拖白便，解剖后發現部分病魚腸道發紅、充水，選取100尾，隨機分成2組，每組50尾。其中，試驗組拌飼投喂中草藥復方制劑YCJ微粉，每千克配合顆粒飼料添加中草藥復方制劑10 g(1%)，對照組僅投喂配合顆粒飼料，每日早晚各投喂1次，連續投喂30 d。投喂期間，記錄試驗組與對照組的魚體死亡情況，并在投喂試驗結束后計算相對保護率。

取樣和高通量測序分析：在投喂試驗開始前及投喂結束后，分別從投喂中草藥復方制劑YCJ的試驗組中隨機取3尾大菱鲆，置于解剖盤中，體表用75%酒精棉球擦拭，然后用滅菌的剪刀鑷子將魚體解剖并剝離出腸道，用剪刀剪取中腸組織，擠出內容物至無菌離心管中，同時將腸道剪開用無菌生理鹽水沖洗4次，將組織放入離心管中，用組織勻漿機勻漿均勻。3尾魚的腸道內容物和組織分別混合成一個樣本，共有4個樣品，分別為中草藥投喂前魚體腸道樣品(IT-C)與內容物樣品(IC-C)，及中草藥投喂結束后魚體腸道樣品(IT-T)與內容物樣品(IC-T)。利用QIA amp DNA stool Mini Kic(Qiagen)提取樣品中的細菌總DNA。以引物5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′和3′-CCTACGGGA GGCAGCAG-5′PCR擴增樣品中細菌16S rDNA V1～V3區序列。PCR的反應體系總體積25 μL，包含5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP(100 mmol/L)5 μL， 引物(10 μmol/L)各1 μL，Q5? High-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，DNA 模板2 μL，無菌去離子水8.75 μL。PCR 反應條件：98 ℃ 下預變性2 min，98 ℃下變性15 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進行30個循環；最后在72 ℃延伸5 min。擴增好的DNA 序列，經瓊脂糖電泳檢測陽性后交由上海派森諾公司利用Roche 454 FLX+測序平臺進行序列測定。

數據分析流程：首先對高通量測序的原始下機數據根據序列質量進行初步篩查，對于雙端序列還需根據重疊堿基進行配對連接。通過質量初篩的序列按照引物和Index信息，識別分配入對應樣本，并去除嵌合體等疑問序列。對獲得的高質量序列進行可操作分類單元劃分，每個可操作分類單元的代表序列用于分類地位鑒定以及系統發育學分析。根據可操作分類單元在不同樣本中的豐度分布，評估每個樣本的多樣性水平，并通過稀疏曲線反映測序深度是否達標。隨后繪制韋恩圖，對各樣本在不同分類水平的具體組成進行分析。在上述分析結果的基礎上，通過多種多變量統計學分析工具，進一步衡量不同樣本間的群落結構差異及與差異相關的可操作分類單元，構建豐度分布高度相關的可操作分類單元關聯網絡。進行 Alpha多樣性分析，計算豐富度指數，包括計算 Chao 指數、香農指數、ACE指數與辛普森指數衡量樣本物種多樣性。

2 結果與分析

2.1 中草藥復方制劑YCJ及11種抗菌中草藥單方對魚類致病菌和腸道菌的抑菌效果

利用平板打孔法測定了中草藥復方制劑YCJ及配方中11種單方對11種魚類致病菌和腸道菌的體外抑菌效果。結果顯示，不同菌株對不同中草藥的敏感性存在一定差異，整體而言，石榴皮、五倍子對11種測試菌的抑菌效果最明顯，平均抑菌直徑大于18 mm，其次為半枝蓮，平均抑菌直徑約14 mm，而部分中草藥卻未表現出明顯的抑菌效果，如金銀花、敗醬草、馬齒莧等(表1)。中草藥復方水提液對不同菌種的抑菌效果為各中草藥單方的中間水平，且同樣對不同的菌株表現出差異抑菌效果，其中對副溶血弧菌、哈維氏弧菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，抑菌圈直徑大于8 mm，其次為嗜水氣單胞菌與愛德華氏菌，抑菌圈直徑為7 mm，而對產氣腸桿菌、奇異變形桿菌、魯菲不動桿菌3種腸道細菌的抑菌直徑均小于5 mm。

2.2 測序結果的質量分析

對4個樣品的高通量測序數據進行統計(表2)，結果顯示，各樣品獲得的高質量序列數量均超過40 000條，保持在一個相當的水平，而腸道內容物樣品中的可操作分類單元數量略高于腸道組織，說明腸道內容物中的細菌多樣性高于腸道組織中的細菌多樣性。反應樣品多樣性的Chao1、ACE、辛普森、香農指數值統計結果同樣表明，腸道內容物中微生物群落的多樣指數值略高于腸壁上的群落多樣性，且在投喂中草藥后群落的多樣性有進一步的提升。利用QIIME軟件對可操作分類單元豐度矩陣中每個樣本的序列總數在不同深度下隨機抽樣，以每個深度下抽取到的序列數及其對應的可操作分類單元數繪制稀疏曲線(圖1)，隨著隨機抽取的序列數進一步增加，各樣品曲線逐漸趨于平緩, 表明有效測序數量已經能夠較好地覆蓋菌種的多樣性，本次取樣深度可信，測序結果能夠真實地反映樣品中優勢細菌的數量關系。

表1 中草藥水提液對魚類致病菌及腸道菌的抑菌圈直徑 mm

表2 各樣品中高通量測序數據統計

圖1 各樣品高通量測序結果的稀釋性曲線

2.3 各樣品中細菌多樣性及優勢可操作分類單元 種類的豐度分析

以97%相似性水平為標準劃分可操作分類單元，IT-C、IT-T、IC-C與IC-T 4個樣品數據分別可劃分為352、372、388和405個可操作分類單元，利用R語言工具統計和作圖軟件制作豐度等級曲線圖(圖2)，每條折線代表一個樣本的可操作分類單元豐度分布，折線在橫軸上的長度反映了該樣本中可操作分類單元數的多少，代表了群落的豐富度，折線越長表示樣本中的可操作分類單元數越多；折線的平緩程度則反映了群落組成的均勻度，折線越平緩，群落組成的均勻度越高，折線越陡峭，則群落中各可操作分類單元間的豐度差異越大，均勻度越低。因而，結果顯示投喂中草藥后腸道(IT-T)及腸道內容物(IC-T)樣品中的菌落豐富度略高于投喂前樣品，且其菌落組成的均勻度也高于投喂前。對各個樣品細菌多樣性的相互關系進行分析，并構建韋恩圖(圖3)。在中草藥投喂前后大菱鲆腸道壁及腸道內容物中相對比例超過70%的可操作分類單元都屬共有可操作分類單元。在腸道內容物樣品中，中草藥投喂前后共有155個差異可操作分類單元，而在腸道壁樣品中，中草藥投喂前后106個可操作分類單元發生了差異變化。

圖2 各樣品間的多樣性比較

圖3 各樣品中細菌多樣性的相關性分析圖中數字為各樣本中的可操作分類單元數量.

進一步對不同樣品中的細菌門類及相對豐度進行統計， 結果顯示變形菌門、厚壁菌門、柔膜菌門、擬桿菌門、放線菌門、酸桿菌門、藍藻門與梭桿菌門是各樣品的優勢門類。其中變形菌門與厚壁菌門的細菌類群占總菌群的90%以上(表3)。進一步對各樣品中優勢細菌目的統計結果顯示，優勢細菌目主要包括根瘤菌目、乳桿菌目、芽孢桿菌目、弧菌目、伯克氏菌目、支原體目、放線菌目、梭菌目、假單胞菌目、腸桿菌目、腐螺旋菌目，其中在腸道內容樣品中乳桿菌目與芽孢桿菌目細菌比例在投喂中草藥后的比例較投喂前有較為明顯的提升，而弧菌目、假單胞菌目及支原體目細菌的比例有較為明顯的下降，而在腸道樣品中除支原體目與假單胞菌目細菌比例有明顯降低之外，其他目的細菌比例無明顯差異(表4)。

表3 各樣品中優勢細菌門類及其相對豐度百分比 %

表4 各樣品中優勢細菌目類及其相對豐度百分比 %

2.4 中草藥復方制劑YCJ對患腸炎大菱鲆的治療效果

中草藥投喂組與正常飼料投喂對照組的病魚在投喂試驗開始后的前兩周均出現了相似的死亡率，但在連續投喂兩周后，中草藥投喂組病魚的死亡率顯著低于對照組，至投喂試驗結束時，中草藥投喂組病魚的累計死亡率為18%，而投喂普通飼料的對照組累計死亡率為34%，計算中草藥投喂組的相對保護率為47%(圖4)。

圖4 中草藥復方制劑YCJ對患腸炎大菱鲆的治療效果

3 討 論

3.1 中草藥的抑菌活性

近年來，隨著中藥化學和中藥免疫藥理學研究的開展，現已證明200多種中草藥具有多種活性物質，中草藥不但含有大量的生物堿、揮發油、苷類、有機酸、鞣質、多糖等多種免疫活性物質和一些促生長活性物質，而且還含有一定量的蛋白質、氨基酸、糖類、脂肪、礦物質、維生素、微量元素、植物色素等營養物質，這些成分可以促進動物機體的新陳代謝和蛋白質、酶的合成，提高免疫力，降低發病率和死亡率[18-20]。另外，已發現多種中草藥具有顯著的抑菌活性，羅新等[21]研究了42 種中草藥對嗜水氣單胞菌的體外抑菌試驗，發現冰片、五倍子、烏梅、石榴皮、訶子、黃連和艾葉7 種中草藥水提原始藥液能夠有效抑殺嗜水氣單胞菌；李茜等[22]測定了23種中草藥及復方對鯽魚(Carassiusauratus)腸道3種細菌的體外抑菌效果，發現五倍子和石榴皮具有極強的抑菌甚至殺菌活性，能夠明顯抑制金黃色葡萄球菌及嗜水氣單胞菌的生長。已有的研究結果與本研究測定的中草藥體外抑菌效果基本一致。另外，本研究根據中草藥功效和配伍，在11種抑菌中草藥配方基礎上，添加了神曲、雞內金、仙鶴草與艾葉等成分制成中草藥復方制劑YCJ，并測定了中草藥復方制劑YCJ的體外抑菌特性，發現該復方制劑體外抑菌效果為單方中間水平，且對不同的菌株表現出差異抑菌效果，其中對副溶血弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、愛德華氏菌等水產動物致病菌表現出較好的抑制效果，而對產氣腸桿菌、奇異變形桿菌、魯菲不動桿菌3種腸道細菌則抑制效果不明顯，推測該復方制劑將在有效控制病原菌增殖的情況下，不會對魚體腸道微生態平衡造成較大影響。

3.2 中草藥復方制劑對患病大菱鲆腸道菌群結構的影響

在許多水生動物中并不存在非常穩定的固有菌群，水體及食物攝入等外界因素是影響魚類腸道菌群的組分和結構的重要因素[23-26]，魚類所處的不同生理狀態和發育階段均會影響消化道菌群的構成[27]。基于本研究對各樣品中優勢細菌門類相對豐度百分比分析結果，變形菌門和厚壁菌門在養殖大菱鲆腸道中占據優勢地位，該結果與前期對其他種類海水及淡水魚腸道菌群的研究結果[28-30]吻合，說明變形菌門和厚壁菌門是魚類腸道的固有細菌門類，但是它們在不同魚類腸道中所發揮的作用目前仍不明確。尹軍霞等[31]發現，魚體腸壁菌群結構與腸道內容物菌群存在一定差異，相比內容物腸道壁上定殖的菌群更為穩定。本研究基于優勢菌群比例的統計結果顯示，大菱鲆在投喂中草藥治療前后腸道壁上的微生物菌群比例變化顯著小于腸道內容物，韋恩圖分析結果也顯示在中草藥投喂前后腸道內容物中差異可操作分類單元數量大于腸壁樣品，說明魚體腸壁上的微生物菌群的結構與組成相對于腸道內容中的菌群更為穩定，更不易受外界因素影響。魯增輝等[32]在對養殖鱸鯉(Percocyprispingi)腸道菌群組成分析結果也同樣顯示，其腸道內容物菌群要比腸壁菌群更為豐富。

已有研究表明，腸道微生物與宿主共同構建的腸道微生態系統對宿主消化代謝、腸道發育、體內平衡、免疫響應與抵御疾病等過程中發揮著至關重要的作用，因此腸道微生物也被許多學者稱為宿主的外在器官，一個正常平衡的腸道微生物群體會對宿主的腸道免疫調節功能產生積極的影響，而一個比例失調的微生物群體則會造成宿主免疫調節功能紊亂，并且增加疾病發生的機率[33-36]。隨著中草藥被越來越多人認可，它對腸道菌群的影響與作用機理研究也得到一定開展[37-38]。基于本研究對大菱鲆在中草藥投喂前后腸道中優勢細菌目類相對豐度的差異變化數據分析顯示，中草藥投喂后腸道壁及腸道內容物樣品中的菌落豐富度略高于投喂前樣品，且其菌落組成的均勻度也高于投喂前。優勢菌群比例的變化分析結果顯示，大菱鲆腸道壁在投喂后支原體目與假單胞菌目細菌有較大比例的下降，在腸道內容物中弧菌目、假單胞菌目及支原體目細菌的比例有較為明顯的下降，乳桿菌目與芽孢桿菌目細菌比例在中草藥投喂后的比例較投喂前有較為明顯的提升，這些結果提示魚體在患腸炎后腸道內細菌菌群的結構會受到影響，其菌落組成的均勻度會有所下降，而在患病大菱鲆腸道樣品中的高比例弧菌、假單胞菌及枝原體菌群提示其與腸炎疾病存在一定相關性，而在中草藥投喂治療后腸道中的乳桿菌目與芽孢桿菌目細菌比例上升有助于腸道恢復健康。陸志款等[39-40]研究同樣顯示，在飼料中添加中草藥對紅笛鯛(Lutjanuserythopterus)和鯉魚腸道中腸桿菌和弧菌屬細菌表現出一定的抑制效果。

3.3 中草藥復方制劑對大菱鲆細菌性腸炎的治療作用

腸炎病是大菱鲆工廠化養殖過程中常見而且危害較大的疾病之一，目前常規的治療方式以抗生素拌飼投喂為主。長期使用抗生素，不僅提高了病原菌的耐藥性，同時會破壞魚體正常腸道菌群結構，造成菌群失調加重病情。因此，本研究基于不同中草藥的藥理特性，選擇了具有清熱解毒作用的黃柏、紅藤、石榴皮、白花蛇舌草、半枝蓮、金銀花、白頭翁，具有解表止瀉的葛根、黃連，具有化濕燥濕的蒼術、茯苓，具有理氣效果的木香，具有消導消脹作用的神曲、雞內金和白術以及具有止血誘食的仙鶴草與艾葉配伍形成中草藥復方制劑YCJ[41-42]。治療試驗結果表明，投喂研制的中草藥復方制劑能夠改善患腸炎病魚腸道發紅、白便的癥狀，最終降低病魚的死亡率，顯示出對大菱鲆腸炎病良好的治療效果。

綜上，本試驗研究了一種復方中草藥制劑YCJ的體外抑菌效果及對工廠化養殖大菱鲆腸炎病的治療效果，并初步揭示了患腸炎大菱鲆在拌飼投喂中草藥后腸道壁與腸道內容物中的菌群結構特征與差異變化，研究結果為大菱鲆抗腸炎中草藥的研制及微生態調控技術的構建提供理論依據，同時也為大菱鲆的防病抗病及健康養殖提供了重要的參考數據。