菊苣酸對活性氧誘導脂質和DNA氧化損傷的影響

肖海芳，付晶晶，王友玲，李凡玥，宋元達

（山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255000）

當機體受到各種有害因素的刺激時，體內氧化和抗氧化系統之間的平衡被破壞，引起自由基的蓄積，最終導致氧化應激[1-2]。過量自由基攻擊體內脂蛋白、脂質體、微粒體和細胞膜等引起脂質過氧化[3-5]。脂質過氧化產物能夠改變生物膜的完整性和滲透性，并使其結構改變、功能喪失[6]；低密度脂蛋白發生脂質過氧化后結構改變，其氧化產物具有促動脈粥樣化和促炎作用[7]。另外，脂質過氧化產物還具有致突變、致癌等毒性[8]。研究證明，脂質過氧化是心腦血管疾病、癌癥、神經失調和衰老等疾病的潛在誘因[9-11]。肝臟組織和腦組織作為動物體內重要的器官，在自由基誘導作用下能夠發生脂質過氧化，導致肝臟和腦組織損傷。丙二醛（malondialdehyde，MDA）一直被視為脂質過氧化的標記物，硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）能夠與MDA反應，生成粉紅色化合物，該物質在532 nm波長處有吸收峰，因此通過分光光度法對其濃度進行檢測非常簡單、快捷[12]。

除脂質過氧化外，氧化應激也會引起蛋白氧化損傷和DNA鏈斷裂、DNA堿基修飾等形式的氧化損傷[13]。另外，脂質過氧化次級產物活性羰基化合物能夠修飾蛋白和DNA等生物大分子[14-15]。DNA作為人類最重要的遺傳物質，其氧化損傷能加速細胞的衰老、凋亡，導致神經退行性疾病、炎癥和癌癥等疾病的發生[16-18]。研究證實，阿爾茨海默癥患者腦組織中DNA氧化產物的水平明顯升高[19]。

許多研究者致力于尋找有效的天然抗氧化劑，以減輕自由基對機體生物大分子的氧化損傷[20-21]。菊苣酸是來源于菊苣和紫錐菊等植物的一種多酚類化合物，具有多種功能活性[22-23]，但目前鮮有其抗氧化活性的系統報道。研究顯示，灌胃菊苣酸后，在SD大鼠肝臟和腦組織中檢測到菊苣酸[24]。基于以上，本實驗擬從生物大分子角度系統研究菊苣酸的抗氧化活性。前期實驗結果表明，菊苣酸對蛋白質氧化損傷具有一定的保護作用。本研究將進一步以小鼠肝勻漿和小鼠腦勻漿為脂質模型，以鯡魚精DNA和pBR322質粒DNA為DNA模型，通過Cu2＋/H2O2和2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride，AAPH）分別誘導其氧化損傷，探討菊苣酸對脂質和DNA氧化損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

健康雄性SPF級昆明小鼠15 只，體質量（20±2）g，購自第四軍醫大學實驗動物中心，生產許可證號為SCXK（陜）2007-001。實驗用昆明小鼠的飼養管理按照國家相關規定進行。

菊苣酸（純度≥98%）、AAPH 美國Sigma公司；pBR322質粒DNA 大連寶生物工程有限公司；鯡魚精DNA 北京百瑞金生物科技有限公司；TBA 美國TEDIA公司；三氯乙酸 天津市博迪化工有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1700型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；DY89-Ⅱ型勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；5419R型高速離心機、移液槍 德國Eppendorf公司；680型酶標儀、PowerPac 220 V電泳供電裝置、水平電泳槽、ChemiDox XRS凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；－80 ℃低溫冰箱 日本SANYO公司；PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器廠；恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；BP211D型萬分之一天平 德國Sartorius公司；VORTEX-5型漩渦混合器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；生化分析型超純水機 成都優普凈化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠組織勻漿的制備

實驗前昆明小鼠以基礎飼料適應性喂養一周，自由飲水。將禁食過夜的昆明小鼠斷頸處死，固定于泡沫板上，摘取肝臟組織和腦組織。用無菌生理鹽水洗去表面血污，剔除脂肪及結締組織。稱取小鼠肝臟組織或腦組織，用眼科剪將其剪碎后加入生理鹽水（1 g組織加入9 g生理鹽水），然后置于冰浴中勻漿5 min。將得到的組織勻漿3 000 r/min冷凍離心10 min，取上清液分裝，－80 ℃保存備用。經檢測小鼠肝勻漿和腦勻漿的脂質質量分數分別為0.32%和0.50%。

1.3.2 菊苣酸對Cu2＋/H2O2誘導組織勻漿脂質過氧化水平的影響

向多支離心管中分別加入組織勻漿（脂質終質量濃度為2 mg/mL）和終濃度為10、100、500、1 000 μmol/L的菊苣酸溶液，混勻后加入終濃度分別為25.0、0.1 mmol/L的H2O2和CuSO4溶液，空白對照組以同體積pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替H2O2和CuSO4溶液，氧化模型對照組以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替菊苣酸溶液。混勻后將各離心管于37 ℃孵育90 min，檢測組織勻漿脂質過氧化程度。

1.3.3 菊苣酸對AAPH誘導組織勻漿脂質過氧化水平的影響

菊苣酸與組織勻漿的處理方法同1.3.2節。一定體積AAPH溶液經熱分解后分別加入各離心管中，使其終濃度為100 mmol/L；空白對照組以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替AAPH溶液，氧化模型對照組以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替菊苣酸溶液。混勻后將各離心管于37 ℃孵育4 h，檢測組織勻漿脂質過氧化程度。

1.3.4 菊苣酸對Cu2＋/H2O2誘導DNA氧化損傷的影響

一定體積鯡魚精DNA（終質量濃度為2 mg/mL）或pBR322 DNA（終質量濃度為20 ng/μL）分別與終濃度為25、50、100、200 μmol/L的菊苣酸溶液混合均勻，封口膜封口后置于37 ℃水浴中孵育30 min，然后分別向各樣品中加入終濃度分別為1.0、0.1 mmol/L的H2O2和CuSO4溶液，空白對照組以同體積pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替H2O2和CuSO4溶液，氧化模型對照組以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替菊苣酸溶液。混勻后將各樣品于37 ℃孵育90 min，檢測DNA氧化損傷程度。

1.3.5 菊苣酸對AAPH誘導DNA氧化損傷的影響

DNA與菊苣酸的處理方法同1.3.4節。終濃度為10 mmol/L的AAPH溶液熱分解后加入各樣品中，空白對照組以同體積pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替AAPH溶液，氧化模型對照組以同體積的pH 7.4磷酸鹽緩沖液代替菊苣酸溶液。將各樣品于37 ℃孵育4 h，檢測DNA氧化損傷程度。

1.3.6 脂質過氧化水平測定

通過TBA法檢測組織勻漿脂質過氧化程度[25]。向100 μL處理好的脂質樣品中分別加入400 μL 20%的三氯乙酸溶液和400 μL 0.67%的TBA溶液，混勻，置于沸水浴中15 min。冷卻后5 000 r/min離心10 min。取上清液于532 nm波長處測吸光度。最終結果以脂質過氧化程度表示，根據公式（1）計算。

式中：As為樣品組在532 nm波長處的吸光度，At為Cu2＋/H2O2或AAPH單獨處理組在532 nm波長處的吸光度。

1.3.7 鯡魚精DNA氧化損傷的測定

采用TBA法檢測鯡魚精DNA氧化損傷程度[21]，具體操作同1.3.6節。最終實驗結果以鯡魚精DNA氧化損傷程度表示，計算公式同式（1）。

1.3.8 DNA瓊脂糖凝膠電泳

取處理好的DNA反應液，加入2 μL上樣緩沖液，混合均勻，上樣，進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓為100 V，時間為30 min。電泳結束后，采用CHEMIDOCXRS凝膠成像系統對膠片成像，采用Quantity one軟件對條帶進行半定量分析，定量結果以超螺旋pBR322 DNA相對含量表示，根據公式（2）計算。

式中：Hc為超螺旋pBR322 DNA條帶灰度；Hk為開環pBR322 DNA條帶灰度。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 菊苣酸對小鼠肝勻漿脂質過氧化水平的影響

圖1 菊苣酸對Cu2＋/H2O2誘導小鼠肝勻漿脂質過氧化水平的影響Fig. 1 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced lipid peroxidation of mouse liver homogenate

圖2 菊苣酸對AAPH誘導小鼠肝勻漿脂質過氧化水平的影響Fig. 2 Effect of chicoric acid on AAPH-induced lipid peroxidation of mouse liver homogenate

作為人體最重要的代謝器官，肝臟中脂質受到自由基攻擊后易發生脂質過氧化，引起肝細胞損傷。動物肝勻漿常被用作脂質模型研究活性物質的抗氧化作用[26-27]。由圖1、2可以看出，Cu2＋/H2O2和50 mmol/L AAPH單獨處理后，小鼠肝勻漿脂質過氧化水平與空白對照組相比均明顯升高。加入10～1 000 μmol/L菊苣酸孵育后，Cu2＋/H2O2誘導體系中小鼠肝勻漿脂質過氧化水平呈不同程度的下降趨勢，并且在10～500 μmol/L濃度范圍內存在濃度依賴關系，而濃度為1 000 μmol/L的菊苣酸雖然對組織勻漿脂質過氧化也有一定的抑制作用，但與500 μmol/L菊苣酸相比作用效果減弱。上述結果說明，菊苣酸在一定濃度范圍內能夠抑制Cu2＋/H2O2誘導的小鼠肝勻漿脂質過氧化，但在高濃度時抑制作用減弱。在AAPH誘導體系中，10 μmol/L菊苣酸對小鼠肝勻漿無明顯保護作用，但100～1 000 μmol/L濃度的菊苣酸對小鼠肝勻漿脂質過氧化均具有明顯抑制效果，且呈濃度依賴關系。

2.2 菊苣酸對小鼠腦勻漿脂質過氧化水平的影響

除脂肪組織外，腦是人體脂肪含量最高的組織。腦組織中脂質極易受到自由基破壞，導致多種神經退行性疾病的發生。由圖3、4可以看出，Cu2＋/H2O2和AAPH誘導體系均能明顯升高小鼠腦勻漿的脂質過氧化水平。在Cu2＋/H2O2誘導體系中，10～1 000 μmol/L菊苣酸均能明顯降低小鼠腦勻漿的氧化損傷程度，提示菊苣酸對小鼠腦勻漿具有明顯的保護作用；與圖1結果相似，濃度為1 000 μmol/L的菊苣酸對小鼠腦勻漿的保護效果也明顯減弱。在AAPH誘導體系中，菊苣酸在10～1 000 μmol/L濃度范圍內對小鼠腦勻漿均具有明顯的保護作用，且濃度越高，菊苣酸對小鼠腦勻漿的保護效果越強。

圖3 菊苣酸對Cu2＋/H2O2誘導小鼠腦勻漿脂質過氧化水平的影響Fig. 3 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced lipid peroxidation of mouse brain homogenate

圖4 菊苣酸對AAPH誘導小鼠腦勻漿脂質過氧化水平的影響Fig. 4 Effect of chicoric acid on AAPH-induced lipid peroxidation of mouse brain homogenate

2.3 菊苣酸對鯡魚精DNA氧化損傷的影響

DNA是活性氧自由基攻擊的重要靶分子之一。受到自由基攻擊后，DNA發生堿基修飾和鏈斷裂，DNA氧化損傷與多種疾病的發生發展有密切關系。自由基攻擊DNA會產生MDA和大量的氧化產物。其中MDA可與TBA反應生成硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）。由于TBARS在532 nm波長處有最大吸收峰，因此，可通過532 nm波長處吸光度衡量DNA樣品氧化損傷的程度[28]。532 nm波長處吸光度越大，表明DNA樣品氧化損傷越嚴重。圖5、6結果顯示，Cu2＋/H2O2和AAPH誘導后鯡魚精DNA氧化損傷程度均明顯上升。25～100 μmol/L菊苣酸對Cu2＋/H2O2誘導體系中鯡魚精DNA具有較好的保護作用，但濃度升至100 μmol/L時菊苣酸對其保護效果開始呈減弱趨勢；當濃度增加為200 μmol/L時，菊苣酸的保護作用消失。25～200 μmol/L菊苣酸對AAPH誘導的鯡魚精DNA氧化損傷均具有明顯的保護作用，且濃度越高，菊苣酸的保護效果越強。

圖5 菊苣酸對Cu2＋/H2O2誘導鯡魚精DNA氧化損傷的影響Fig. 5 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced oxidative damage to herring sperm DNA

圖6 菊苣酸對AAPH誘導鯡魚精DNA氧化損傷的影響Fig. 6 Effect of chicoric acid on AAPH-induced oxidative damage to herring sperm DNA

2.4 菊苣酸對pBR322 DNA氧化損傷的影響

圖7 菊苣酸對Cu2＋/H2O2誘導pBR322 DNA氧化損傷的影響Fig. 7 Effect of chicoric acid on Cu2+/H2O2-induced oxidative damage to pBR322 DNA

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測pBR322 DNA超螺旋結構向開環結構及線性結構的轉變，以反映DNA的氧化損傷程度[29]。由圖7可見，空白對照組pBR322 DNA幾乎全部以超螺旋結構存在，而經Cu2＋/H2O2處理90 min后，以開環形式存在的pBR322 DNA明顯增多，說明Cu2＋/H2O2誘導體系產生的羥自由基使pBR322 DNA發生氧化損傷，并破壞其超螺旋結構。以1～10 μmol/L菊苣酸孵育后，具有超螺旋結構的pBR322 DNA明顯增多，并呈濃度依賴關系。雖然50 μmol/L菊苣酸對Cu2＋/H2O2誘導pBR322 DNA氧化損傷也有一定的保護作用，但與10 μmol/L菊苣酸處理組相比保護作用降低；100μmol/L菊苣酸對Cu2＋/H2O2誘導pBR322 DNA氧化損傷無保護作用，甚至表現出促氧化作用。上述結果說明，菊苣酸在低濃度時能夠抑制Cu2＋/H2O2誘導pBR322 DNA氧化損傷，但在高濃度時具有促氧化作用。圖8為菊苣酸對AAPH誘導體系中pBR322 DNA超螺旋結構的影響。

圖8 菊苣酸對AAPH誘導pBR322 DNA氧化損傷的影響Fig. 8 Effect of chicoric acid on AAPH-induced oxidative damage to pBR322 DNA

由圖8可以看出，10 mmol/L AAPH單獨處理后，pBR322 DNA超螺旋結構明顯被破壞。pBR322 DNA經1～200 μmol/L菊苣酸孵育后，其超螺旋結構明顯增多；菊苣酸濃度為25～200 μmol/L時，以超螺旋結構形式存在的pBR322 DNA與空白對照組相比無明顯差異。

3 結 論

本研究以不同濃度菊苣酸分別孵育脂質和DNA模型，通過Cu2＋/H2O2產生的羥自由基和AAPH產生的烷氧自由基誘導后，分析菊苣酸對脂質和DNA氧化損傷的影響。結果表明，對羥自由基誘導的脂質和DNA氧化損傷，菊苣酸在一定濃度范圍內具有明顯的抑制作用，但高濃度菊苣酸對二者的保護作用減弱或呈現促氧化作用。在烷氧自由基誘導體系中，菊苣酸對脂質和DNA具有明顯保護作用，且菊苣酸濃度越高，保護效果越好。上述實驗結果與菊苣酸對小鼠組織蛋白氧化損傷的作用結果基本一致。