硒化低聚氨基多糖對RAW264.7細胞的免疫調節作用

顧麗霞，鄭 斌,，相興偉,,，聞正順,，周宇芳，馬劍茵，曲有樂

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋開發研究院，浙江 舟山 316021）

硒是機體必需微量元素，缺硒會引起多種疾病，如兒童的營養不良、食欲不振、潰瘍性結腸炎、關節炎、大骨節病、心血管疾病、免疫力低下等[1]。美國食品和營養委員會提出成人每天攝入硒的安全范圍推薦量為50～200 μg。自然界中的硒元素主要以無機硒和有機硒兩種形式存在，雖均能被機體吸收，但相對而言，有機硒化合物毒性遠低于無機硒，且生物利用率更高；因此有機硒已逐步成為醫藥、食品保健等諸多領域的研究對象[2]。有機硒主要是硒蛋白、硒多糖等，其中硒多糖為硒和多糖的結合產物，該化合物既能有效避免補充無機硒所引起的毒性反應，又保留了多糖的生物活性；且研究表明，硒多糖的生物活性不只是硒和多糖活性的簡單相加，其更是具備較高的或新的生物活性，易于機體吸收和利用[3-4]。天然硒多糖一般存在于植物或微生物中，但普遍含量較低，且提取方法還不夠成熟，提取成本較高，因此制約了其開發應用。通過多糖硒化修飾或人工合成等化學方法獲得硒多糖是解決上述問題的有效途徑，當前這項研究正處于起步階段，目前已成功合成了南瓜、茶和大蒜等植物多糖硒酸酯[5-7]。

殼聚糖是由廣泛存在于蝦、蟹等甲殼類動物外殼中的天然高分子聚合物——甲殼素分子脫乙酰基后的產物，其是天然有機化合物中數量僅次于纖維素的一大類含氮有機化合物，是一種豐富的可再生資源[8]，因殼聚糖還具有一些獨特的生物活性，如抗微生物、抗氧化、增強免疫功能、抑制腫瘤等；因此被廣泛應用于生物醫藥、食品工程等領域[9-11]。目前已有研究證實水溶性的低分子質量殼聚糖能顯著增強正常小鼠的部分免疫指標，提高小鼠的免疫能力[12]，但針對殼聚糖的硒化修飾及體外免疫調節活性研究較少。本實驗依據課題組前期研究的優化結果[13]，通過化學合成法，在體外適宜的條件下使低聚氨基多糖與無機硒結合獲得硒化低聚氨基多糖（low molecular seleno-aminopolysaccharide，LSA）。所得LSA硒含量為27.3 mg/g，其中由Na2SeO3提供硒源，所用的低聚氨基多糖（亦稱低分子殼聚糖）分子質量約為50 kDa。

巨噬細胞以不同形式廣泛分布于機體不同組織中，是具有多種功能的免疫效應細胞，其不但參與機體的特異性免疫反應和非特異性免疫反應，而且是兩種免疫反應聯系的“橋梁細胞”。巨噬細胞不僅能夠分泌多種細胞因子及炎癥介質，且對病原微生物及癌細胞表現出較高的吞噬能力，能夠殺滅和消化機體內抗原性異物[14]。此外，巨噬細胞也能發揮專職抗原遞呈細胞的作用，將抗原加工處理并遞呈給抗原特異性T、B淋巴細胞，啟動免疫反應。因此，本實驗以小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞作為研究對象，探討LSA對巨噬細胞RAW264.7免疫活性的影響，為LSA在免疫學方面的研究利用提供參考依據，同時促進硒源的開辟以及殼聚糖資源的合理深加工。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LSA由本實驗室合成。RAW264.7小鼠單核巨噬細胞系由浙江大學贈予。

高糖杜爾伯科改良依格爾培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）、澳洲胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰酶 美國Gibco公司；總RNA提取（total RNA isolation，TRIzol）試劑 美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10及腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、噻唑藍（methyl thiazol tetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；引物通過Primer Premier 5.0軟件設計，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SeriesⅡ細胞培養箱、Multiskan FC全自動酶標儀 美國Thermo Scientific公司；OptiMair?垂直流超凈工作臺 新加坡藝思高科技有限公司；DMIRB型倒置顯微鏡 德國Leica公司；5415D高速冷凍離心機德國Eppendorf公司；ND-2000核酸蛋白定量儀 美國Thermo Scientific公司；MyCycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；ABI ViiA? 7實時熒光定量PCR儀 美國Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及處理

RAW264.7細胞用含10%胎牛血清的DMEM（高糖）完全培養液于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中傳代培養。實驗取指數生長期的RAW264.7細胞，經預熱磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次，然后用1 mL 0.25%胰酶消化2～3 min，加入DMEM（高糖）完全培養液終止消化，反復輕柔吹打，收集細胞，用PBS洗滌2 次，細胞計數板進行計數，根據實驗需要調整細胞濃度進行鋪板，用于后續實驗。

1.3.2 MTT法檢測細胞增殖活性

對數生長期RAW264.7細胞按1×104個/孔接種至96 孔板，過夜培養后棄上清液，分別加入含不同硒質量濃度的LSA（硒的終質量濃度分別為100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600 μg/L）或Na2SeO3（硒的終質量濃度分別為100、150、200、250、300、350、400、450、500 μg/L）培養液200 μL，空白對照組只加DMEM（高糖）完全培養液。每組設置6 個復孔，37 ℃、5% CO2培養30 h。之后棄培養液，每孔加入200 μL含MTT（MTT終質量濃度為0.5 mg/mL）的新鮮細胞培養液，繼續孵育4 h，4 000 r/min離心10 min，小心吸去各孔液體，并加入150 μL二甲基亞砜溶解生成的甲臜，于490 nm波長處測定吸光度。依照公式（1）計算細胞相對增殖率。

1.3.3 RAW264.7細胞形態的變化

對數生長期RAW264.7細胞按2×105個/孔接種至6 孔板，過夜培養后棄上清液，在LSA處理組中分別加入含不同質量濃度硒的LSA（200、600、1 000 μg/L）培養液2 mL，陽性對照組加入終濃度為500 ng/mL的LPS，37 ℃、5% CO2培養24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.3.4 中性紅法檢測細胞吞噬能力

對數生長期RAW264.7細胞按1×104個/孔接種至96 孔板，過夜培養后棄上清液，按實驗分組分別進行加藥處理。實驗分組如下：空白對照組、陽性對照組（500 ng/mL LPS）和不同硒質量濃度（100、200、400、600、800、1 000 μg/L）的LSA處理組。細胞孵育24 h后，棄上清液，每孔加入200 μL含0.075%中性紅的生理鹽水繼續培養4 h，預熱PBS洗滌3 遍，每孔加入200 μL乙醇-乙酸溶液（含50%乙醇、1%乙酸、49%水）于4 ℃靜置過夜，通過酶標儀在540 nm波長處測定溶液吸光度，并按公式（2）計算中性紅吞噬率。

1.3.5 細胞因子分泌水平測定

RAW264.7細胞按3×105個/孔密度接種至6 孔板，過夜培養后棄上清液，按如下分組進行加藥處理。1）空白對照組：DMEM（高糖）完全培養基培養；2）陽性對照組：DMEM（高糖）完全培養基中加入終質量濃度為500 ng/mL的LPS；3）LSA組：完全培養基中加入不同硒質量濃度（200、600、1 000 μg/L）的LSA；4）Na2SeO3組：以低劑量LSA組中硒質量濃度為準，完全培養基中加入相同硒質量濃度（200 μg/L）Na2SeO3；5）低聚氨基多糖組：以低劑量LSA組中低聚氨基多糖濃度為準，完全培養基中加入相同質量濃度低聚氨基多糖（低聚氨基多糖的終質量濃度7 126 μg/L）；6）Na2SeO3＋低聚氨基多糖組：以低劑量LSA組中LSA的硒質量濃度及低聚氨基多糖濃度為準，完全培養基中加入相同硒質量濃度200 μg/L的Na2SeO3及7 126 μg/L低聚氨基多糖。其中LSA及Na2SeO3的添加量均以硒計算。

采用不同的處理時間（細胞處理24 h后，檢測IL-6及TNF-α的質量濃度；細胞處理30 h后，檢測IL-10的質量濃度）孵育細胞，到規定處理時間后收集細胞上清液，1 500 r/min離心5 min取上清液。按照ELISA試劑盒說明書檢測細胞培養液中細胞因子IL-6、IL-10及TNF-α的水平。

1.3.6 細胞因子mRNA相對表達水平的測定

對數生長期RAW264.7細胞按3×105個/孔接種至6 孔板，過夜培養后棄上清液，按照1.3.5節所述實驗分組進行給藥處理。經不同的處理時間（細胞處理18 h后，檢測細胞IL-6及TNF-α mRNA表達情況；細胞處理24 h后，檢測細胞IL-10 mRNA表達情況）孵育細胞后，胰酶消化收集細胞，PBS洗滌3 遍后轉移至無RNA酶的EP管中，加入1 mL預冷TRIzol試劑，反復吹打裂解細胞，凍存于－80 ℃冰箱用于后續檢測。

表1 實時熒光定量PCR反應引物序列Table1 Oligonucleotide primers used in qPCR

根據GenBank已報道的小鼠IL-6、IL-10、TNF-α及β-actin基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設計相應特異性引物，并由上海生物工程公司合成（表1）。取出凍存于－80 ℃冰箱中的細胞，按TRIzol試劑法提取細胞總RNA。用核酸蛋白定量儀檢測OD260nm/OD280nm、OD260nm/OD230nm及RNA質量濃度，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性。檢測后的總RNA根據反轉錄試劑盒（PrimeScript? Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit）說明書反轉錄合成cDNA。按照熒光定量試劑盒（SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）說明書配制PCR體系，反應總體積為20 μL：SYBR Green qPCR mix 10.0 μL、ROXⅡ 0.4 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 6.8 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL。其擴增條件均為預變性50 ℃ 120 s，95 ℃ 10 min；95 ℃變性15 s，相應退火溫度（表1）60 s，循環40 個。熒光的采集與溶解曲線的制作按照熒光定量PCR儀的說明進行。每個樣品靶基因的相對mRNA表達水平用2－??Ct計算，其中以β-actin為內參基因。每個樣品3 個重復。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 LSA、Na2SeO3對RAW264.7細胞增殖的影響

圖1 不同硒質量濃度LSA（A）和Na2SeO3（B）對RAW264.7細胞增殖的影響Fig. 1 Effects of different selenium concentrations of LSA (A) and sodium selenite (B) on RAW264.7 cell proliferation

由圖1A可知，LSA處理RAW264.7細胞30 h后，相比于空白對照組，硒質量濃度為100～1 000 μg/L的LSA對細胞的相對增殖率無顯著影響；而當LSA硒質量濃度為1 200～1 600 μg/L時，細胞的相對增殖率則顯著降低（P＜0.05）。由圖1B可知，Na2SeO3處理RAW264.7細胞30 h后，與空白對照組比較，硒質量濃度為100～200 μg/L的Na2SeO3對RAW264.7細胞增殖無顯著影響；而當Na2SeO3的硒質量濃度大于250 μg/L時，細胞的相對增殖率顯著降低（P＜0.05）。

比較不同硒質量濃度LSA、Na2SeO3對RAW264.7細胞增殖率的影響，Na2SeO3細胞毒性大，安全使用范圍窄，當硒質量濃度超過200 μg/L時，細胞增殖率驟然降低，且隨著硒質量濃度的增大，細胞相對增殖率快速下降；而LSA細胞毒性相對較小，安全適用范圍更廣。

2.2 LSA對RAW264.7細胞形態的影響

圖2 不同硒質量濃度LSA對RAW264.7細胞形態的影響（×200）Fig. 2 Effects of different selenium concentrations of LSA on morphological changes in cultured RAW264.7 cells (× 200)

由圖2可知，通過顯微鏡觀察細胞形態發現，未經處理的RAW264.7細胞體積較小，呈圓形；經LSA處理后的細胞主要呈梭形，隨著LSA硒質量濃度的增加，細胞逐漸伸出偽足且數量不斷增多，呈現一定的劑量依賴關系。而LPS（500 ng/mL）刺激后的細胞，體積明顯增大，呈棱形、多角形或者不規則形，細胞內出現空泡，并伴有大量偽足伸出，部分細胞甚至出現漂浮、凋亡的現象。

2.3 LSA對RAW264.7細胞吞噬作用的影響

圖3 不同硒質量濃度LSA對RAW264.7細胞吞噬作用的影響Fig. 3 Effects of different selenium concentrations of LSA on phagocytosis in RAW264.7 cells

LPS是巨噬細胞的活化劑，可誘導巨噬細胞分化、成熟。從中性紅吞噬實驗結果可知，LPS（500 ng/mL）刺激RAW264.7細胞24 h后，其顯著提高巨噬細胞的吞噬能力（P＜0.05）（圖3）。與空白對照組比較，硒質量濃度為400、600、800、1 000 μg/L的LSA，也能表現出與LPS類似的作用，顯著提高巨噬細胞的吞噬能力（P＜0.05），但與LPS陽性對照組比較，LSA對RAW264.7細胞的刺激效果遠低于LPS組（P＞0.05）。

2.4 LSA對RAW264.7細胞細胞因子分泌水平的影響

圖4 不同硒質量濃度LSA對RAW264.7 TNF-α（A）、IL-6（B）、IL-10（C）分泌水平的影響Fig. 4 Effects of different selenium concentrations of LSA on TNF-α (A), IL-6 (B), IL-10 (C) secretion of RAW264.7 cells

由圖4A可知，LSA處理RAW264.7細胞24 h后，與空白對照組比較，硒質量濃度為200、600、1 000 μg/L的LSA能顯著提高RAW264.7 TNF-α分泌水平（P＜0.05）。由圖4B可知，LSA處理RAW264.7細胞24 h后，與空白對照組比較，硒質量濃度為200 μg/L的LSA對細胞的IL-6分泌水平無顯著影響；而當LSA的硒質量濃度為600、1 000 μg/L時，IL-6的分泌水平顯著提高（P＜0.05）。由圖4C可知，LSA處理RAW264.7細胞30 h后，與空白對照組比較，硒質量濃度為200、600、1 000 μg/L LSA能顯著提高RAW264.7 IL-10分泌水平（P＜0.05）。但與LPS陽性對照組比較，各LSA處理組的TNF-α、IL-6及IL-10分泌水平都遠遠低于。Na2SeO3處理組、低聚氨基多糖處理組及Na2SeO3＋低聚氨基多糖復合添加處理組對RAW264.7 TNF-α、IL-6分泌水平均無顯著性增強作用。

通過上述實驗結果可知，當硒質量濃度均為200 μg/L時，LSA處理組相比于Na2SeO3單獨處理組、低聚氨基多糖處理組及Na2SeO3＋低聚氨基多糖復合添加處理組，更能有效刺激RAW264.7細胞分泌細胞因子，提高機體免疫能力。但與LPS陽性組比較，LSA刺激細胞所產生的細胞因子水平與遠低于LPS組。

2.5 LSA對RAW264.7細胞細胞因子mRNA表達水平的影響

由圖5A可知，與空白對照組比較，當LSA處理細胞18 h后，硒質量濃度為200、600、1 000 μg/L的LSA顯著提高RAW264.7細胞TNF-α mRNA表達水平（P＜0.05），且呈劑量依賴性。圖5B顯示，LSA處理細胞18 h后，相比于空白對照組，硒質量濃度為200 μg/L的LSA對RAW264.7 IL-6 mRNA表達水平無顯著影響；而當LSA的硒質量濃度達600、1 000 μg/L時，RAW264.7 IL-6 mRNA表達水平顯著提高（P＜0.05）。圖5C顯示，相較于空白對照組，200、600、1 000 μg/L LSA處理細胞24 h能顯著提高RAW264.7 IL-10 mRNA表達水平（P＜0.05）。LSA雖能在一定程度上提高TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA表達水平，但其刺激效果遠低于LPS（P＜0.05）。Na2SeO3組、低聚氨基多糖組及Na2SeO3＋低聚氨基多糖復合添加組對RAW264.7 TNF-α、IL-6、IL-10 mRNA表達水平均無顯著影響。相同硒質量濃度下，LSA對RAW264.7細胞的作用效果優于Na2SeO3組、Na2SeO3＋低聚氨基多糖復合添加組。

3 討 論

巨噬細胞在機體免疫防御、自身穩定及免疫監視中均起著舉足輕重的作用。巨噬細胞是天然免疫應答的主要參與者[15-16]，活化的巨噬細胞可以直接殺傷病原微生物、抑制腫瘤細胞生長、清除凋亡細胞和突變細胞，并通過分泌TNF-a、IL-1、IL-6及NO等免疫活性分子參與和調控天然免疫防御和特異性免疫應答[17-19]。

大量研究表明，硒為機體必需微量元素之一，參與機體多種生物系統，如氧化還原系統、內分泌系統、免疫調節系統及生殖系統等[20-22]，可是當其以無機硒的形式使用時毒性較大，不慎過量攝入會對機體造成嚴重的毒害作用。本實驗MTT結果也顯示，相比于Na2SeO3，LSA作為一種有機硒化合物對RAW264.7細胞的毒性作用小，安全使用范圍更廣，這與文獻[23]報道的結果基本一致。巨噬細胞是繼上皮細胞屏障后抵抗病原菌感染的第一道防線，當病原微生物侵入機體出現病理性變化時，巨噬細胞會通過識別抗原表面的受體，使自身活化，進而增強吞噬能力及時清除病原體。中性紅實驗結果顯示，LSA能顯著增強RAW264.7細胞的吞噬活性，提示LSA可增強巨噬細胞病原體吞噬作用，從而保護機體免受感染。活化的巨噬細胞還會通過分泌各種細胞因子（TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β等）及炎癥介質（NO、前列腺素等）調控機體免疫應答反應，當然這些細胞因子的表達和調控并不是獨立的，而是相互作用、相互協調的[24]。其中TNF-α是活化巨噬細胞殺滅病原體的主要效應因子，同時也是典型的前炎癥細胞因子，其可介導天然免疫和獲得性免疫，激活免疫細胞，并啟動其他細胞因子的分泌，前炎癥細胞因子的適量產生有助于激發機體正常的免疫功能，利于機體抵御感染；但過量產生則會對機體產生負面影響，造成不同程度的損傷[25-26]。巨噬細胞根據功能特性及其誘導產生的Th1型或Th2型免疫應答的不同，通常相應地分為M1和M2兩型[27-28]。TNF-α即是M1型巨噬細胞的標志性細胞因子，具有直接殺傷腫瘤細胞的功能；IL-6和IL-10則是M2型細胞的標志性細胞因子，IL-6既具有促炎的功效，同時又具備一定的抗炎作用[29]，而IL-10則主要發揮抗炎的作用，控制機體炎癥反應程度[30]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，在動物細胞實驗中，常被用于誘導炎癥的發生。免疫學研究中則常以RAW264.7細胞為研究對象，通過LPS建立相應的炎癥模型，從而進行一系列的實驗探討。LPS會致使巨噬細胞產生大量的炎癥性因子，進而形成瀑布效應使巨噬細胞過度活化，表現出強烈的炎癥反應，甚至引發死亡[31]。本次細胞實驗顯示，經LPS刺激的RAW264.7細胞，體積明顯增大，細胞內出現許多空泡，并伴有大量偽足產生，部分細胞甚至出現漂浮、凋亡的現象，同時細胞培養液中炎癥細胞因子IL-6、TNF-α及抗炎細胞因子IL-10水平均急劇大幅度上升，表明RAW264.7細胞免疫功能被過度激活。而經LSA處理的RAW264.7細胞IL-6、TNF-α分泌水平雖也上升，但其刺激效果遠比LPS弱，且LSA在增加促炎癥細胞因子分泌的同時也增強了抗炎細胞因子IL-10的分泌水平，提示LSA在激活RAW264.7細胞免疫功能的同時也避免過度刺激細胞，維持免疫平衡狀態。此外，基因水平檢測到的細胞因子mRNA表達水平與ELISA結果基本一致，說明LSA可能通過促進細胞因子基因表達量來調控細胞因子的分泌水平，進而對RAW264.7細胞起到一定的免疫調節作用。同時，通過比較同等硒質量濃度下Na2SeO3單獨處理組和Na2SeO3＋低聚氨基多糖復合添加組的作用效果可知，LSA組的免疫調節效果更好。

綜上所述，LSA作為一種有機硒化合物能顯著增強RAW264.7細胞的吞噬能力，并促進細胞TNF-α、IL-6和IL-10分泌及其mRNA表達水平，提示LSA可通過刺激巨噬細胞誘導產生新的Th1/Th2免疫平衡反應，從而提高機體免疫能力。本研究為將LSA開發成為一種綠色補硒保健產品提供了一定的理論依據，同時拓寬硒源及殼聚糖資源的合理利用范圍。