泰山灰樹花母種及液體菌種最佳培養條件的研究

劉姍姍，孟麗，趙姣姣，王麗穎，朱孟娟

（山東農業大學植物保護學院，山東泰安271018）

泰山灰樹花（Grifola frondosa）是泰山特有的一種野生珍稀食藥用真菌，其肉質脆嫩、香味濃郁，味道鮮美，口味極佳，深受當地人們的喜愛[1]。多分布于海拔700 m～1 100 m的范圍內，在泰山的夏、秋季節，常生長于栗樹等闊葉樹的周圍[2]。

從分類上來說，泰山灰樹花屬于層菌綱（Hymenomycetes）、非褶菌目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）、灰樹花屬（Ramalina），它的子實體呈珊瑚狀分枝，末端扇形或匙形，重疊成簇[3-4]。灰樹花不僅富含高質量的氨基酸、膳食纖維、微量元素、維生素、有機酸等[5]，還含有很多活性物質如多糖[6-8]、糖蛋白[9-10]、蛋白質或肽類[11-12]等，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂、降膽固醇、調節血糖、抑制糖尿病、提高免疫力等功效，是一種極具開發價值的功能性食藥用真菌[13-18]。

有關泰山灰樹花的研究主要集中在生物學特性、人工栽培、海藻糖及多糖的提取3個方面。蘇延友等研究了泰山灰樹花的生物學特性及人工培育技術[2]。有研究報道，泰山灰樹花子實體的最適生長溫度為22℃左右，環境相對濕度為90%，生長階段要求有較強的散射光，可覆土栽培[19]。李艷玲等對泰山灰樹花液體深層發酵的培養基進行了優化并從中提取了海藻糖[20]。李曉倩則通過微波輔助的方法從泰山灰樹花菌絲體中提取了多糖物質[21]。在以上的研究中，研究者對泰山灰樹花母種培養條件的研究大多不系統，而且缺少泰山灰樹花液體菌種培養方面的相關報道。因此，本研究將對泰山灰樹花母種和液體菌種的最佳培養條件進行研究，以補充和填補相關數據，為泰山灰樹花的人工栽培提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

泰山灰樹花4號：山東農業大學菌物基地保存。

1.1.2 培養基

基礎培養基：葡萄糖20g，蛋白胨2 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，瓊脂 20 g，水 1 L，pH 值自然。

液體培養基：葡萄糖20g，酵母膏2 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，水 1 L，pH 自然。

1.1.3 試劑與設備

葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、瓊脂：購于山東省泰安市普天公司。

SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；G180T立式自動壓力蒸汽滅菌鍋：致微儀器有限公司；H2P-250全溫培養振蕩器：上海精宏實驗設備有限公司；DGT-G250電熱鼓風干燥箱：合肥華德科學器材有限公司；RXZ-380A-LED智能人工氣候箱：寧波江南儀器廠；SHP-250生化培養箱：上海培因實驗儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 泰山灰樹花母種培養基最適碳源的篩選

采用單因素試驗法，在基礎培養基的基礎上，分別以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉5種糖作為碳源，依次代替基礎培養基中的葡萄糖，制備相應的培養基，共制備5種不同碳源的培養基。121℃滅菌30 min后，倒入直徑為90 mm的無菌平板中，冷卻待用。利用打孔器將準備好的泰山灰樹花平板菌種打成直徑7 mm的圓形菌片，定量接種于上述做好的平板培養基中央，每個平板接種一個菌片，每種培養基接種3個平板。接種完成后，置于24℃恒溫培養箱中黑暗培養，3天后每天定時測量并記錄菌絲的生長長度（十字交叉法測量）、長勢及邊緣的整齊度，并計算菌絲的日均增長量。

Affected individuals carry the risk for colorectal,endometrial and ovary, genitourinary tract, stomach, hepatobiliary, pancreas and small bowel cancers (Figure 3).

1.2.2 泰山灰樹花母種培養基最適氮源的篩選

分別以蛋白胨、酵母膏、尿素、NH4NO3作為氮源，依次代替基礎培養基中的蛋白胨，參照1.2.1中的方法制作平板培養基并接種，每種培養基接種3個平板，然后置于24℃恒溫培養箱中黑暗培養，3天后每天定時測量并記錄菌絲的生長長度（十字交叉法測量）、長勢及邊緣的整齊度，并計算菌絲的日均增長量。

1.2.3 測定不同添加物對泰山灰樹花菌絲生長的影響

參照1.2.1和1.2.2的試驗結果，設計本試驗的培養基配方為：葡萄糖20 g，酵母膏2 g，添加物100 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，瓊脂 20 g，水 1 L，pH 值自然。添加物分別為栗樹木屑和栗樹樹葉。具體操作為：先將添加物放入水中煮沸10 min，過濾取濾液，然后再加入葡萄糖、酵母膏等其它成分，制作成培養基。121℃滅菌30 min后，倒入直徑為90 mm的平板中，冷卻待用。利用打孔器將準備好的泰山灰樹花平板菌種打成圓形菌片，定量接種于上述做好的平板培養基中央，每個平板接種一個菌片，每種添加物培養基做3個重復。接種完成后，置于24℃恒溫培養箱中黑暗培養，3天后每天定時測量并記錄菌絲的生長長度（十字交叉法測量）、長勢及邊緣的整齊度，并計算菌絲的日均增長量。

1.2.4 測定泰山灰樹花菌絲生長的最適溫度

參照1.2.1、1.2.2和1.2.3的試驗結果，確定本試驗的培養基配方為：葡萄糖20 g，酵母膏2 g，栗樹木屑100 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，瓊脂 20 g，水 1 L，pH值自然。按照培養基配方制作培養基并滅菌待用。按照1.2.1的方法定量接種后，分別置于22、24、26、28、30℃恒溫培養箱中培養，每個溫度設3個重復。3天后每天定時測量并記錄菌絲的生長長度（十字交叉法測量）、長勢及邊緣的整齊度，并計算菌絲的日均增長量。

參照1.2.1、1.2.2和1.2.3的試驗結果，確定本試驗的培養基配方為：葡萄糖20 g，酵母膏2 g，栗樹木屑100 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，水 1 L，pH 值自然。按照培養基配方制作液體培養基，倒入250 mL的三角瓶中，每瓶150 mL，然后用1 mol/L的HCl和NaOH調節培養基的 pH 值，使其分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，每種pH值設置3個重復，121℃滅菌30 min后，冷卻待用。分別用打孔器取泰山灰樹花平板菌種6片接種于三角瓶內，然后置于溫度為24℃、轉速為160 r/min的恒溫振蕩培養箱中振蕩培養。10天后測定培養液中菌絲體的干重。

1.2.5 泰山灰樹花液體菌種培養條件的優化

利用正交試驗設計法，以轉速、接種量和溫度為3個因素，以菌絲體干重為參考指標，進行三因素三水平的正交試驗，具體設計參照表1。

表1 正交試驗因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiment

本試驗的液體培養基配方同試驗1.2.4。按照培養基配方制作培養基后，倒入250 mL的三角瓶中，每瓶150 mL，共制作27瓶。然后參照表1中的參數，將事先準備好的泰山灰樹花液體菌種搖勻后用移液管定量接種到三角瓶中，每個試驗設3個重復。接種完成后，參照表1的培養條件進行培養。10天后測定每瓶發酵液中菌絲體的干重。

1.2.7 數據分析與處理

所有試驗設置3個重復，結果以平均值±標準差的形式表示。

2 結果與分析

2.1 泰山灰樹花母種培養基最適碳源的篩選

利用單因素試驗法，分別以葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、淀粉5種糖作為碳源，測定其對泰山灰樹花菌絲生長的影響，試驗結果如表2所示。

表2 不同碳源對泰山灰樹花菌絲生長的影響Table2 The effect of different carbon sources on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

從表2中可以看出，以葡萄糖作為碳源，培養得到的菌落直徑最大（73.10 mm），且菌落邊緣整齊，菌絲顏色潔白。以果糖作為碳源培養的的菌落直徑和以麥芽糖為碳源培養的菌落直徑雖然相差不大，但果糖作為碳源培養的的菌落邊緣比麥芽糖為碳源培養的菌落邊緣整齊。以蔗糖和淀粉作為碳源培養的菌落直徑最小。綜上分析可知，泰山灰樹花菌絲生長最適碳源為葡萄糖。

2.2 泰山灰樹花母種培養基最適氮源的篩選

分別以酵母膏、蛋白胨、尿素和硝酸銨作為氮源，測定其對泰山灰樹花菌絲生長的影響，試驗結果如表3所示。

表3 不同氮源對泰山灰樹花菌絲生長的影響Table3 The effect of different nitrogen sources on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

從表3中可以看出，培養10天后，以酵母膏作為氮源培養的菌落直徑最大，為58.25 mm，而且菌絲潔白，菌落邊緣整齊。在蛋白胨和硝酸銨作為氮源的培養基上，菌絲長速相差不大，但在以硝酸銨為氮源的培養基上，菌落邊緣不規則。在以尿素為氮源的培養基上，菌絲不能生長。綜上分析，泰山灰樹花最最適的氮源為酵母膏。

2.3 測定不同添加物對泰山灰樹花菌絲生長的影響

通過測定不同添加物對泰山灰樹花菌絲生長的影響，得到結果如表4所示。

表4 不同添加物對泰山灰樹花菌絲生長的影響Table4 The effect of different additives on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

從表4中可以看出，與對照組相比，添加栗樹木屑和栗樹樹葉都能夠在一定程度上促進菌絲的生長，但添加栗樹木屑后，菌絲生長的速度最快，到第10天時菌落直徑達到78.83 mm，而且菌絲潔白，菌落邊緣整齊。

2.4 測定泰山灰樹花菌絲生長的最適溫度

分別測定不同溫度對泰山灰樹花菌絲生長的影響。結果如表5所示。

表5 不同溫度對泰山灰樹花菌絲生長的影響Table5 The effect of different temperature on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

從表5中可以看出，在20℃～30℃的范圍內，菌絲均能生長。但溫度在24℃時，菌絲生長10天后，菌落的直徑最大，菌絲生長速度最快，且菌落邊緣整齊，所以培養泰山灰樹花菌絲的最適溫度為24℃。

2.5 測定泰山灰樹花菌絲生長的最適pH值

通過測定不同pH值下泰山灰樹花菌絲生長10天后的菌絲體干重，得到表6。

表6 不同酸堿度對泰山灰樹花菌絲生長的影響Table6 The effect of different pH on the growth of Taishan Grifola frondosa mycelium

從表6中可以看出，在pH值為6時，菌絲體的干重最多，且菌絲球數量最多，密實。在pH值為5時，菌絲體干重稍小一些，但菌絲球也很多，說明在pH值5～6的范圍內，菌絲生長狀況最好，最適合的pH值為6。pH值低于5或高于6時，菌絲生長狀況不佳。

2.6 泰山灰樹花液體菌種培養條件的優化

以轉速、接種量和溫度為3個因素，以菌絲體干重為參考指標，對泰山灰樹花液體菌種培養條件進行三因素三水平的正交試驗，結果如表7所示。

分析表7中的R值可知，這3個因素對泰山灰樹花液體菌種的影響程度依次為B＞A＞C，即接種量＞轉速＞溫度。分析表中的K值，可以看出各因素水平優選的最佳方案為A1B3C2，對應于試驗編號7，而從菌絲體干重來看，也是7號試驗的菌絲體干重最重，為7.32 g/L。因此通過正交試驗得出，泰山灰樹花液體菌種在轉速120 r/min，接種量20 mL，溫度為24℃的條件下培養，效果最佳，培養10天后的菌絲體干重為7.32 g/L。

表7 泰山灰樹花液體菌種培養條件正交試驗結果Table7 The results of cultivation conditions for Taishan Grifola frondosa liquid spawn by orthogonal test

3 結論

本試驗主要針對泰山灰樹花母種和液體菌種的培養條件進行了研究。通過單因素試驗，確定了泰山灰樹花母種的最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母膏，適合的添加物為栗樹木屑，培養的最適酸堿度為pH 6.0，培養的最適溫度為24℃。通過對轉速、接種量和溫度三因素進行正交試驗，確定了泰山灰樹花液體菌種的最佳培養條件為：轉速120 r/min，接種量20 mL，溫度24℃。在此條件下培養出的泰山灰樹花液體菌種表現出分散性好、菌絲生長旺盛、菌齡一致等特點。以上試驗數據對于泰山灰樹花的人工栽培和推廣具有重要的參考價值。