毛細管柱氣相色譜法對果蔬汁和調味料中脫氫乙酸及4種對羥基苯甲酸酯的測定

林澤鵬，林晨，王李平，方麗，張方圓，李雪瑩，湯遜尤，潘云山

（中國廣州分析測試中心，廣東省分析測試技術公共實驗室，廣東 廣州 510070）

食品安全一直是國家關注問題的焦點之一，在一系列的食品當中添加少量的防腐劑可以起到延長食物保質期的作用，而添加過量的防腐劑則會威脅到人類的身體健康。本文研究對象為果蔬汁及調味料中兩類防腐劑的測定，即脫氫乙酸和4種對羥基苯甲酸酯（對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯）。脫氫乙酸別名二乙酰基乙酰乙酸，是一種低毒高效的防腐劑、防霉劑，防腐效果是苯甲酸鈉的2～10倍，在酸堿條件下均有一定的抗菌作用，尤其對霉菌的抑制作用最強[1]。脫氫乙酸是能夠迅速被人體所吸收，進入人體后即分散于血漿和許多器官中，有抑制體內多種氧化酶的作用[2]。對羥基苯甲酸酯俗稱尼泊金酯，包括有甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等，是一類高效防腐劑，對霉菌、酵母及細菌有廣泛的抗菌作用[3]。它的優勢在于成本低，毒性小及適用范圍廣[4]。由此可見脫氫乙酸和對羥基苯甲酸酯類在食品中應用范圍特別廣，是人們每天都接觸到的其中一類食品為調味料和生活中常飲用的果蔬汁飲料等，在國家發布最新版食品安全國家標準GB 2760-2014《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中果蔬汁、復合調味料，對羥基苯甲酸酯和脫氫乙酸使用量分別不得超過0.3 g/kg和0.5 g/kg，而對羥基苯甲酸酯（以對羥基苯甲酸計）果蔬汁及部分調味料使用量不得超過0.25 g/kg。

據文獻報道，目前能夠檢測脫氫乙酸和對羥基苯甲酸酯的方法眾多，比如我國現行國家標準和行業標準氣相色譜法、高效液相色譜、高效液相色譜質聯/質聯法等[5-9]，這幾種標準均存在前處理方面操作繁瑣、消耗溶劑多、成本高，不利于環保，從色譜條件大多進樣時間較長，效率低，不適于做批量樣品的檢測。其他的毛細管柱氣相色譜法和快速測定法[10-14]以及液相色譜法[15-18]，這些方法大多能準確定性定量，但是快速檢測法檢出限較高，很難達到微量檢測的要求，有些方法只能檢測的樣品種類比較單一，甚至只能檢測高含量的樣品，大部分檢測方法樣品范圍較小，且不能同時測定脫氫乙酸和對羥基苯甲酸酯。所以很有必要建立了一種快速、高效、準確、成本低且可以同時測定果蔬汁和調味料中脫氫乙酸、對羥基苯甲酸酯的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

7890A氣相色譜儀配氫火焰離子化檢測器：美國安捷倫儀器有限公司；XW-80A微型渦旋混合儀、超聲清洗儀：上海瀘西分析儀器有限公司；TDZ5-WS離心機：湖南塞特湘儀科技有限公司；N-EVAP氮吹儀：美國Organomation。

1.1.2 標準物質及試劑

脫氫乙酸（2 mg）：中國計量科學研究院；對羥基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯（2 mg）：Dr.Ehrenstorfer；乙酸乙酯、鹽酸、乙醇、正己烷：廣州化學試劑廠。

1.1.3 標準溶液的配制

分別把脫氫乙酸、4種對羥基苯甲酸酯用乙醇配制成濃度為1 000 μg/mL的混標儲備液。

1.2 方法

稱取5 g樣品（精確至0.000 1 g）置于50 mL離心試管中，含油樣品先用正己烷30 mL除油兩次（除油過程乳化時需離心），加入體積比1∶1鹽酸0.50、10 mL乙酸乙酯，在微型漩渦混合儀振蕩2 min，靜置15 min，放于離心機離心。重復兩次合并提取液，在45℃氮吹儀濃縮至5 mL，供氣相色譜分析。

1.3 色譜條件

色譜柱：DB-1701（30 m×320 mm×0.25 μm）；柱溫150℃，以10℃/min升至240℃保持4 min；進樣口220℃；采用不分流模式進樣，進樣量1 μL；FID檢測器，270℃；載氣為氮氣，流量2 mL/min；氫氣流量40 mL/min；空氣流量400 mL/min；尾吹氣流量：45 mL/min。

2 結果與討論

2.1 溶劑的選擇

能夠提取脫氫乙酸以及對羥基苯甲酸酯的溶劑有多種，以乙醚、丙酮、乙腈、乙醇、乙酸乙酯提取脫氫乙酸的回收率見圖1。

圖1 溶劑的回收率Fig.1 Recovery of solvents

由圖1可知，乙醚、丙酮沸點較低易揮發，導致回收率不高，乙醇和水不易分離，乙腈和乙酸乙酯提取回收率差異不顯著，但是乙腈的沸點較高，濃縮耗時長，所以選用乙酸乙酯作為本試驗方法的提取溶劑。

2.2 色譜柱分離效果及測定結果

按照1.2方法處理，分別抽查了9種果蔬汁和16種調味料進行檢測分析，分析結果如表1，標準圖譜和部分陽性樣品及空白圖譜見圖2。

圖2 5種標準物質混合溶液，陽性樣品及空白樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of five standard materials mixed solution，positive sample and blank sample

在1.3的色譜條件下，采用毛細管柱DB-1701及FID檢測器測定后，清晰的可以看到脫氫乙酸和4種對羥基苯甲酸酯很好的分離開，出峰順序良好，彼此之間無干擾，達到良好的分離效果，每個樣分析時間在10 min內就完全出峰，總時間為14 min走完。由圖2幾種目標物出峰順序和分離效果可看出，使用本方法的色譜條件明顯優于國家標準色譜條件，彼此之間無干擾且分析時間短，作為批量檢測節省大量時間。圖中出現基線不夠平穩是因為不同樣品中可能存在多種不同的干擾成分，基質樣品本身帶有少量油脂影響及后序升溫過快導致，可以按照本文的除油方法進行去除，達到最佳效果，但升溫程序完全不影響目標峰，可以忽略。

2.3 標準曲線、線性關系、相關系數及檢出限

1.1.3 混合標準溶液稀釋成濃度同為：10、20、50、100、200 μg/mL的線性混合標準溶液，進樣分析。以色譜峰面積（Y）對質量濃度（X）進行回歸分析，計算得到相應的回歸方程，以3倍信噪比基線噪聲為1.0 pA·s計算本方法檢出限，各項數據詳見表2。

表1 各樣品的檢測結果Table1 Results of each sample

表2 脫氫乙酸、4種對羥基苯甲酸酯的線性關系、相關系數及檢出限Table2 Linear relationship，correlation coefficient and detection limit of dehydroacetic acid and four kinds of p-hydroxybenzoate

由表2的數據可以看出本方法檢出限以及各項數據均滿足目前國內食品中脫氫乙酸及對羥基苯甲酸酯類的檢測要求。

2.4 回收率及精密度

取陰性樣品5 g進行測定，以線性濃度的20、50、100 μg/mL為加標濃度，按照上述1.2前處理方法進行處理分析測定，每個加標濃度平行加標3次，以標準物質保留時間定性，外標法定量，計算出脫氫乙酸和4種對羥基苯甲酸酯的回收率和相對標準偏差，各項目的3次加標回收率以及相對標準偏差的結果詳見表3。

表3 各濃度平均值及加標回收率和相對標準偏差（n=3）Table3 Average concentration，standard recovery and relative standard deviation（n=3）

表3表明該方法精密度和準確度、重現性良好，本方法能夠滿足分析要求。

3 結論

脫氫乙酸和對羥基苯甲酸酯都是食品中常見的防腐劑，為了保證食品的安全，很有必要建立一種快速、高效低成本低且實用的方法，本方法為毛細管柱氣相色譜法不只對果蔬汁及調味料的檢測，對大部分食品都適用。從分析角度上講科學性和可操作性優于目前國內外標準且分析時間短、準確性高、溶劑用量少，能滿足大批量樣品檢測要求。