不同前處理方式對米糠復合酶解效果影響的研究

韓雅盟，池建偉，張名位，韓素云，魏振承，林耀盛，范三紅，*

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所/農業部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室，廣東廣州510610）

我國的稻米產量位居世界首位，米糠作為稻米精碾過程中的主要副產物，資源豐富，同時富含蛋白質、不飽和脂肪酸、膳食纖維以及微量元素、維生素、多酚等多種生理活性物質。然而，米糠在加工利用中常常容易腐敗、味道變差并且伴有不易蒸煮、口感粗糙等問題，使其在農副產品中的應用受到了嚴重的限制，因此通過合適的前處理來改進米糠的加工性狀成為米糠在加工利用中急需解決的問題[1-2]。此外，由于米糠的基本營養素大都與其細胞壁聯結在一起，存在較差的溶解性，不便利用，因此使用酶工程來更改米糠細胞壁的結構，將結合態轉變為游離態物質，并使其細胞壁上可溶性物質溶解出來，逐漸成為國內外農副產品加工利用的重要手段。

世界上有關改善米糠加工利用性狀的研究報道十分廣泛。歐克勤等[3]研究中性蛋白酶、風味蛋白酶以及堿性蛋白酶對米糠中蛋白質溶解性的影響，結果顯示中性蛋白酶酶解米糠與風味蛋白酶及堿性蛋白酶相比具有更好的溶解性。王雪飛等[4]使用纖維素酶能增加米糠蛋白的提取率。唐卿雁等[5]利用果膠酶和纖維素酶催化浸提米糠油，提高了米糠油的得率；Shih等[6]通過使用糖苷酶來降解米糠中淀粉和纖維素，得到新型功能食品原料，然而其原料利用率不到30%，限制了應用。Parrado等[7]在堿性條件下采用復合內切蛋白酶酶解米糠制得多肽，同時其酶解液具有抗腫瘤的功能。現階段，擠壓膨化、微波蒸煮和高溫焙炒等加工方式是農副產品加工利用的重要手段。Jennifer等[8]采用擠壓膨化處理麥麩，發現其水溶性非淀粉多糖含量得到提高，但是其多酚含量及其抗氧化活性降低。趙穎等[9]研究了擠壓膨化對萌芽糙米品質的影響，發現擠壓膨化能改善糙米的沖調分散性，同時最大程度保留萌芽糙米的營養成分。Garcia等[10]采用微波處理米糠，產生濃郁的香甜味道，植酸含量下降，食用品質得到改善，米糠的穩定性得到提高。

現階段國內外對米糠的研究主要集中在米糠穩定化及其單一營養組分的提取分離，對米糠整體加工利用的研究較少，造成米糠加工利用率低。雖然酶工程已經應用于米糠的加工利用，但是不同前處理對米糠酶解效果的研究未見報道。本文以脫脂米糠為原料優化建立脫脂米糠復合酶解工藝條件并進一步將不同前處理技術與酶解技術相結合，比較擠壓膨化、微波蒸煮和高溫焙炒3種前處理方式對米糠酶解效果的影響，旨在為米糠在食品中深度加工利用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮全脂米糠：廣東省農業科學院水稻研究所提供，過40目篩去雜，于-18℃密封保存備用；脫脂米糠：采用亞臨界萃取方法，脂肪含量為（1.0±0.2）%；纖維素酶（35 000 U/g）：廣州齊云生物技術有限公司；α-淀粉酶（20 000 U/g）：北京奧博星生物技術有限公司；沒食子酸和兒茶素標準品：上海Aladdin公司；其它試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

CBE-5L亞臨界流體萃取實驗室成套裝置：河南省亞臨界生物技術有限公司；DS32型雙螺桿擠壓膨化機：濟南賽信膨化機械有限公司；DHG-9425A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司；格蘭仕G90W-25MSP-WB微波爐：格蘭仕電器有限公司；K8400半自動凱氏定氮儀：濟南來寶醫療器械有限公司；TD6離心機：長沙湘智離心機儀器有限公司；Eyelan-1100旋轉蒸發儀：東京理化器械株式會社；Tecan Infinite M200多功能酶標儀：瑞士Tecan科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合酶解米糠工藝條件優化試驗

1.3.1.1 酶解工藝流程

脫脂米糠+水（1∶15，g/mL）混合→均質→加入纖維素酶，α-淀粉酶→酶解→滅酶→離心（4 400 r/min，30 min）→上清液備用。

工藝要點如下：

1）均質：脫脂米糠+水（1∶15，g/mL）混合均勻后在高速均質機上均質3 min。

2）滅酶：將酶解米糠置于沸水浴中10 min滅酶。

1.3.1.2 復合酶酶解米糠工藝單因素試驗

根據預備試驗確立了復合酶組成：纖維素酶與α-淀粉酶。以可溶性固形物含量為評價指標，分別評價酶配比、溫度、pH值和復合酶添加量對酶解效果的影響。具體條件如下：

1）酶配比：固定料液比 1 ∶15（g/mL），復合酶添加量1.50%，溫度48℃，反應時間1.0 h，pH 5.3，酶質量比設定為 1∶0、0∶1、0.5∶1、1.5 ∶1、2.5 ∶1。

2）溫度：固定料液比 1 ∶15（g/mL），酶質量比 1.5 ∶1，復合酶添加量 1.50%，反應時間 1.0 h，pH 5.3，溫度設定為 43、48、53、58、63 ℃。

3）pH 值：固定料液比 1 ∶15（g/mL），酶質量比 1.5 ∶1，復合酶添加量1.50%，溫度48℃，反應時間1.0 h，pH 值設定為 4.3、4.8、5.3、5.8、6.3。

4）復合酶添加量：固定料液比 1 ∶15（g/mL），酶質量比 1.5∶1，溫度 48℃，反應時間 1.0 h，pH 5.3，復合酶添加量設定為1.20%、1.50%、1.80%、2.10%、2.40%。

1.3.1.3 復合酶酶解米糠多因素響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，選取溫度、酶添加量和pH值為自變量，固定纖維素酶與α-淀粉酶酶質量比為1.5∶1，以可溶性固形物含量為響應值，根據Box-Behnken中心組合設計原理，設計響應面分析試驗，其因素水平編碼表見表1。試驗處理設3次重復。

表1 因子水平編碼表Table1 Experimental factors and coding levels in response surface design

1.3.2 不同前處理方式

1）擠壓膨化：控制水分含量為20%，擠壓溫度

1.3.3.2 酶解米糠可溶性糖含量的測定

將米糠酶解上清液過濾后稀釋到一定濃度，取稀釋液0.5 mL于20 mL試管中，加入1.5 mL去離子水，0.5 mL蒽酮-乙酸乙酯溶液和5 mL濃硫酸，混勻，于沸水浴中準確保溫1 min，取出后冷卻，于波長630 nm波長下測定吸光度。

蔗糖標準曲線的回歸方程為：Y=0.008 0X+0.015 2（R2=0.999 4）165℃，擠壓物于55℃電熱恒溫鼓風干燥箱烘干至恒重，粉碎過80目篩，裝入密封袋，-4℃保存。

2）微波蒸煮：650 mL圓形耐熱玻璃碗中稱取30 g脫脂米糠，控制水分含量為40%，微波功率440 W，加熱90 s后于55℃電熱恒溫鼓風干燥箱烘干至恒重，粉碎過80目篩，裝入密封袋，-4℃保存。

3）高溫焙炒：稱取100 g脫脂米糠放入鍋中，加熱至米糠表面溫度達到90℃時開始計時，不間斷翻炒9 min，冷卻后，粉碎過80目篩，裝入密封袋，-4℃中保存。

1.3.3 不同前處理米糠酶解特性試驗

調整纖維素酶與α-淀粉酶復合酶解米糠液pH值至6.5，4 400 r離心30 min，取酶解上清液進行米糠酶解特性試驗。

1.3.3.1 酶解米糠可溶性蛋白含量的測定

采用GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定酶解上清液和脫脂米糠粉中蛋白含量。

1.3.3.3 酶解米糠總酚含量的測定

參照Singleton[11]的方法并略做修改。將米糠酶解上清液過濾后稀釋到一定濃度，取稀釋液1.25 mL，加入0.5 mL去離子水和0.125 mL福林酚試劑，混勻，靜置6 min后加入1 mL去離子水和1.25 mL 7%Na2CO3溶液，混勻，避光靜置90 min，于波長760 nm波長下測定吸光值，同時以0.125 mL甲醇代替米糠酶解液作空白對照，以沒食子酸標準品繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.005X+0.015 9（R2=0.996 8），總酚含量以每100 g米糠干基中所含沒食子酸當量表示簡寫為mg GAE/100 g DW。

1.3.3.4 酶解米糠總黃酮含量的測定

參照Zhishen等[12]的方法并略做修改。將米糠酶解上清液過濾后稀釋到一定濃度，取稀釋液0.3 mL，加入0.09 mL 5%NaNO2和1.5 mL去離子水，混勻，靜置6 min后加入0.18 mL 10%AlCl3·6H2O溶液，混勻，靜置5 min后再加入0.6 mL 1 mol/L NaOH溶液，最后用去離子水補足至3 mL，于波長510 nm下測定吸光值，同時以0.3 mL甲醇代替米糠酶解液作空白對照，以兒茶素標準品繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.003 9X+0.015 2（R2=0.998 3），總黃酮含量結果以每100克米糠干基中所含的兒茶素當量表示，簡寫為mgCE/100gDW。

1.4 數據的統計與分析

采用用SPSS 17.0軟件對數據進行統計與分析，數據以均值±標準誤差（Means±SD）表示，數據統計顯著差異水平為p<0.05，響應面試驗采用Design expert軟件處理。

2 結果與討論

2.1 米糠復合酶解的單因素試驗結果

2.1.1 酶質量比

酶質量比對米糠可溶性固形物含量的影響如圖1-（a）所示。只添加纖維素酶或α-淀粉酶時米糠的可溶性固形物含量較低，尤其是在只添加纖維素酶時最低；當纖維素酶和α-淀粉酶的質量比為1.5∶1時，米糠可溶性固形物含量達到最大值32.65%。

2.1.2 溫度

溫度對米糠可溶性固形物含量的影響如圖1-（b）所示。米糠的可溶性固形物含量隨著溫度的升高呈先升高后下降的趨勢，在48℃達到最大值33.24%。當溫度超過48℃后，提取率開始下降。這可能是因為溫度低于48℃時α-淀粉酶的活性會降低，但溫度升高時候纖維素酶的活性又會受到抑制。

2.1.3 pH值

pH值對米糠可溶性固形物含量的影響如圖1-（c）所示。米糠的可溶性固形物含量隨著pH值的升高呈先升高后下降的趨勢，在pH4.8達到最大值33.37%。pH值大于4.8后，提取率下降顯著。這是因為纖維素酶的最適pH值在3.5～5.0，而α-淀粉酶的最適pH值在5.0～8.0，pH 4.8左右剛好在兩種酶最適pH值的交界處，因而酶解效果最佳。

2.1.4 復合酶添加量

復合酶添加量對米糠可溶性固形物含量的影響如圖1-（d）所示。米糠的可溶性固形物含量隨著復合酶添加量的增大呈上升趨勢，復合酶添加量小于1.8%時增加明顯，添加量大于1.8%后無顯著變化。這是由于隨著酶添加量的不斷增大，已經沒有可以被纖維素酶和α-淀粉酶作用的底物存在。

圖1 不同復合酶酶解條件對米糠可溶性固形物含量的影響Fig.1 Effects of different complex enzymatic hydrolysisconditions on the content of soluble solids ofdefatted rice bran

2.2 米糠復合酶解的響應面優化試驗結果

分別以X1（溫度）、X2（復合酶添加量）和X3（pH值）為自變量，并以-1、0、1 分別代表低、中、高水平，以米糠可溶性固形物含量為響應值Y，試驗結果見表2。通過響應面設計軟件Design expert進行數據分析，經過多元回歸擬合，得到回歸方程模型：

由回歸模型的方差分析（見表3）可知，各因素對米糠可溶性固形物含量的影響強弱依次為溫度＞pH值＞復合酶添加量，其中酶解溫度對米糠可溶性固形物含量的影響達到了極顯著水平。回歸模型顯著（p=0.0114＜0.05）。擬合模型相關系數R2=0.940 0，失擬項不顯著（p=0.116 9＞0.05），說明該回歸方程的擬合度高，可較好地描述各因素于響應值的真實關系。模型給出的最佳酶解條件為酶添加量為1.8%，酶解溫度50.8℃，pH5.1，在此條件下米糠可溶性固形物含量理論值達到35.86%。

表2 試驗方法及試驗結果Table2 Experimental design and results

表3 回歸模型方差分析Table3 Results of regression and variance analysis

圖2顯示了酶用量與酶解溫度對米糠可溶性固形物含量的影響，它們對米糠可溶性固形物含量的影響呈顯著交互作用。固定酶解的pH值在零水平，酶解初始階段，隨著酶解溫度和酶添加量的增加，米糠的可溶性固形物含量逐漸增高，但當酶添加量達到一定水平后，可溶性固形物含量不再發生明顯的變化，超過一定溫度后，提高酶解溫度會略微降低米糠可溶物的提取率。同時可以看出，降低酶解溫度對可溶性固形物含量的影響可以通過增加酶用量得以改善，反之亦然。

圖2 復合酶添加量與酶解溫度對米糠可溶性固形物含量的交互作用Fig.2 Interaction of complex enzyme concentration and temperature on the content of soluble solids ofdefatted rice bran

為檢驗響應面設計所得結果的可靠性，采用上述優化條件進行試驗。考慮到實際操作條件，將酶解工藝條件調整為酶添加量1.8%，酶解溫度51.0℃，pH 5.1。在此條件下，米糠的可溶性固形物含量為35.06%，與理論值相比相差0.80%，試驗結果與預測結果基本一致。

2.3 不同加工方式對米糠酶解效果的影響

2.3.1 可溶性蛋白和可溶性糖

不同前處理方式對復合酶解米糠中可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響見表4。

表4 不同前處理方式對復合酶解米糠中可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響Table4 Effects of different pretreatment on the content of soluble protein and soluble sugar of defatted rice bran by composite enzymatic treatments

由表4可知，與未處理相比，3種前處理方式均顯著降低了復合酶解米糠中可溶性蛋白含量（p＜0.05），擠壓膨化、微波蒸煮、高溫焙炒分別使酶解米糠中可溶性蛋白含量下降了9.04%、3.36%、4.44%。這主要是因為前處理使得米糠中蛋白發生了熱變性，原先包埋在分子內部的疏水基團暴露出來，從而使蛋白質的水溶性降低，擠壓膨化處理由于自身加工條件更劇烈，因而對復合酶解米糠中可溶性蛋白含量影響更為顯著[13]。

與未處理組相比，擠壓膨化和微波蒸煮顯著提高了復合酶解米糠中可溶性糖含量（p＜0.05），分別上升了8.37%、3.77%。高溫焙炒對復合酶解米糠中可溶性糖含量無顯著影響（p＞0.05）。這可能是因為前兩種處理能夠較大程度提高米糠中淀粉的糊化度，糊化的淀粉更易被淀粉酶酶解。

周小理等[14]發現擠壓膨化可以對膳食纖維改性，提高原料中可溶性膳食纖維含量；李杰等[15]發現擠壓膨化前處理可以促進米糠多糖的溶出；鄭喜群等[16]采用擠壓膨化的方法預處理玉米粉，可提高Alcalase酶解玉米粉的水解度；杜雙奎等[17]發現擠壓膨化可以使物料中的淀粉降解，生成小分子量物質，水溶性增強，因而擠壓膨化酶解米糠具有更高的可溶性糖含量。

2.3.2 酚類物質含量

米糠中的多酚自然狀態下常常與米糠中的蛋白質、淀粉等結合，石碧等[18]研究發現當用復合酶，蛋白酶酶解處理米糠時可以使米糠中的多酚釋放出來；何新益等[19]發現糙米發芽處理可以提高糙米的多酚含量，而發芽的過程就是稻谷中大量內源酶，如糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶等被激活和釋放過程。

不同前處理方式對復合酶解米糠中總酚和總黃酮含量的影響見表5。

表5 不同前處理方式對復合酶解米糠中總酚和總黃酮含量的影響Table5 Effects of different pretreatment on the content of total phenols and flavonoids of defatted rice bran by composite enzymatic treatments

由表5可知，與未處理組相比，擠壓膨化顯著降低了復合酶解米糠中總酚含量（p＜0.05），下降了4.99%。高溫焙炒處理略微降低了復合酶解米糠中總酚含量，微波蒸煮對總酚含量無明顯影響（p＞0.05）。

與未處理組相比，3種加工方式對復合酶解米糠中總黃酮含量均無顯著影響（p＞0.05）。因而不同前處理方式不會對酶解米糠中總黃酮含量產生影響。

3 結論

以可溶性固形物含量為評價指標，脫脂米糠最適復合酶解工藝條件為：纖維素酶與α-淀粉酶質量比為1.5∶1，復合酶添加量為 1.8%，溫度 51℃，pH 5.1，米糠可溶性固形物含量達到35.06%。3種前處理方式均降低復合酶解米糠中可溶性蛋白含量，但卻提高了可溶性糖含量；擠壓膨化和高溫焙炒降低了復合酶解米糠中總酚含量；3種前處理方式對總黃酮含量物均無顯著影響。本研究結果可以為米糠飲料的開發提供指導。