重復玻璃化凍融胚胎移植后臨床結局

張宏展，熊風，李觀貴，孫青，陳培林，萬才云，姚志鴻，鐘惠嫻，曾勇

(深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

胚胎冷凍解凍是人類輔助生殖技術(ART)中的一項重要延伸技術，依靠該技術實現(xiàn)胚胎的長期保存，不僅能夠減少ART中藥物控制性促排卵的次數(shù)，充分利用一次促排卵獲得的所有胚胎，提高累積妊娠率；而且還為規(guī)避如內膜容受性差、過度刺激風險高等不利移植時機提供可能，提高單次移植妊娠率[1-2]。因此，未移植的可用胚胎冷凍后保存數(shù)月或數(shù)年后，待適宜時機解凍再移植入母體子宮已經(jīng)是目前IVF-ET過程中的普遍做法，即胚胎移植前經(jīng)歷一次冷凍、一次解凍過程。在實際的臨床工作中，胚胎復蘇移植周期中會遇到一些特殊情況如患者突發(fā)陰道炎、急性感染、發(fā)熱等，導致已經(jīng)復蘇的胚胎無法移植入母體子宮，被迫對胚胎進行重復玻璃化冷凍保存，后續(xù)再行二次解凍移植。本研究擬探討重復冷凍胚胎復蘇后的存活情況及移植后的臨床結局，實現(xiàn)更清楚的患者知情。

資料與方法

一、研究對象

選取2013年1月至2017年9月于本院生殖科行重復玻璃化冷凍胚胎解凍的周期為研究對象，共收集卵裂期胚胎二次解凍周期39個，囊胚二次解凍周期18個。39個卵裂期胚胎解凍周期中，1個周期因胚胎溶解重新解凍其它胚胎移植，4個周期解凍后行囊胚培養(yǎng)未移植，10個周期與一次凍融胚胎混合移植，最終單純移植重復玻璃化卵裂期胚胎周期數(shù)24個。18個囊胚解凍周期中，1個周期因胚胎溶解取消移植，4個周期與一次凍融囊胚混合移植，最終單純移植重復玻璃化囊胚周期數(shù)13個。為了研究重復凍融胚胎移植后的臨床結局，本研究采用傾向性評分匹配的方法在同時期本科室單次凍融胚胎移植的患者中，依據(jù)女性患者的年齡、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質胚胎數(shù)，按1∶3最近鄰匹配法，設定卡鉗值為0.03保證匹配結果的優(yōu)良性，進行傾向性評分匹配，最終分別得到59個卵裂期移植周期和39個囊胚移植周期，作為對照組。對比分析兩組間的胚胎種植率、生化妊娠率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、活胎分娩率等臨床指標。

二、方法

1.促排卵、受精和胚胎培養(yǎng)：促排卵均采用本科室常規(guī)促排方案，優(yōu)勢卵泡≥18 mm時，肌肉注射HCG(默克，德國)，36 h后行陰道B 超穿刺取卵，39 h～41 h后加精受精或ICSI受精，精液優(yōu)化處理采用不連續(xù)密度梯度離心法。受精后放置于37℃，5% CO2、5%O2、90%N2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.胚胎評分與冷凍標準：將Peter卵裂期胚胎評分系統(tǒng)[3]結合本中心實際情況制定出D3卵裂期胚胎的評分標準：1級：卵裂球數(shù)目≥7個，碎片數(shù)量≤10%；2級：卵裂球數(shù)目≥7個，10%<碎片數(shù)量≤20%；3級：卵裂球數(shù)目≥7個，碎片數(shù)量>20%或5≤卵裂球數(shù)目<7個，碎片數(shù)量≤10%；4級：5≤卵裂球數(shù)目<7個，碎片數(shù)量>10%或卵裂球數(shù)目<5個。根據(jù)此評分標準，將1級、2級胚胎定義為優(yōu)質胚胎，一般僅冷凍優(yōu)質卵裂期胚胎。對于囊胚而言，根據(jù)Gardner評分標準，3期及3期以上且內細胞團和滋養(yǎng)層評分不含C的囊胚。

3.玻璃化冷凍與解凍：胚胎冷凍解凍程序采用玻璃化冷凍-快速解凍法。利用玻璃化冷凍/解凍液(SAGE，美國)和Cryotop冷凍載體(Kitazato，日本)進行卵裂期胚胎冷凍/解凍。冷凍及解凍步驟嚴格按照說明書執(zhí)行。重復玻璃化為玻璃化冷凍的胚胎解凍后又再次進行玻璃化冷凍。卵裂期胚胎復蘇后卵裂球數(shù)目≥冷凍胚胎卵裂球數(shù)目一半定義為存活，囊胚復蘇后囊胚腔擴張，細胞未坍陷瓦解為存活。

4.內膜準備與胚胎移植：對于月經(jīng)周期正常且排卵規(guī)律的患者采用自然周期方案，即根據(jù)陰道超聲監(jiān)測，月經(jīng)天數(shù)≥10 d，優(yōu)勢卵泡直徑≥14 mm，子宮內膜達到7～8 mm以上，排卵后D3進行卵裂期胚胎、D5進行囊胚移植。月經(jīng)周期不正常或排卵不規(guī)律的患者采用人工周期方案，即月經(jīng)D3起口服戊酸雌二醇(補佳樂，拜爾，德國)4 mg/d×5 d，根據(jù)內膜情況調整劑量及天數(shù)。15 d后B超監(jiān)測子宮內膜厚度7～8 mm以上時，肌肉注射黃體酮(浙江仙琚制藥)60 mg/d至移植日。B超介導下行胚胎移植術。

5.黃體支持及妊娠判斷：自移植次日改用黃體酮凝膠(默克，德國)90 mg/d置于陰道，直至取卵后 16 d抽血查β-HCG。移植后30 d，B超下見到妊娠囊及原始心管搏動判為臨床妊娠，宮內妊娠則行黃體支持至12周。

6.傾向性評分匹配：SPSS 24.0安裝相應的R插件和psmatching 3.spe，在SPSS菜單中成功生成PS Matching模塊后，按照黃福強等[4]介紹的方法，依據(jù)女方年齡、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質胚胎數(shù)，采用1∶3最近鄰匹配法、設定卡鉗值為0.03保證匹配結果的優(yōu)良性，最終獲得與實驗組協(xié)變量均衡的對照組樣本。

三、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，均數(shù)比較采用t檢驗，百分率的差異性分析采用χ2檢驗，P<0.05定義為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、重復玻璃化冷凍胚胎復蘇情況

本研究共收集卵裂期胚胎重復冷凍解凍周期39個，解凍胚胎57枚，存活55枚，復蘇存活率為96.49%；囊胚重復冷凍解凍周期18個，復蘇胚胎24枚，存活23枚，復蘇存活率95.83%。

二、兩組患者基本資料比較

實驗組卵裂期胚胎移植周期和囊胚移植周期的女方年齡、平均移植胚胎數(shù)、平均移植優(yōu)質胚胎數(shù)、內膜準備過程中的黃體轉化日子宮內膜厚度分別與對照組卵裂期胚胎和囊胚移植周期相比，基本特征均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組移植患者基本資料比較(-±s)

三、移植后臨床結局比較

實驗組與對照組相比，無論在卵裂期胚胎移植周期中還是在囊胚移植周期中，兩組各項指標均呈現(xiàn)相類似的變化趨勢，即實驗組胚胎移植后種植率、HCG陽性率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、活胎分娩率等臨床結局與對照組的單次凍融胚胎移植后的結局無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 各組患者移植后臨床結局比較[(%)]

注：1部分移植周期截至投稿時尚未到隨訪日期;21個周期生產(chǎn)結局失訪。

討 論

ART的快速發(fā)展，胚胎冷凍解凍技術在輔助生殖中的應用越來越廣泛，尤其是玻璃化冷凍方法，自1998 年[5]首次報道成功妊娠以來，在全世界迅速被推廣應用。所謂玻璃化是指液態(tài)的物質在一定的降溫速率下，由液相直接轉變成為一種玻璃狀的固體狀態(tài)的過程，內部沒有晶體結構。對于保存胚胎的溶液，無冰晶的玻璃化狀態(tài)，能保持溶液內的分子和離子分布，阻止了冷凍和解凍過程中溶液在液態(tài)和晶體形態(tài)之間來回轉換，從而避免了冰晶形成對胚胎的物理化學損傷，獲得更好的冷凍效果[6]。在實際應用中，玻璃化冷凍技術也確實獲得良好的效果。大量的文獻研究表明，玻璃化技術的應用對胚胎及子代都是相對安全的[7-8]，玻璃化法冷凍胚胎出生兒也日益增多。然而，畢竟玻璃化冷凍方法是一種非自然狀態(tài)下胚胎經(jīng)歷的人工體外操作方法，其實施過程中高濃度冷凍保護劑的毒性作用、體外操作可能引起的胚胎細胞物理損傷或功能損傷、潛在的病原微生物污染等問題都可能影響胚胎的種植潛能[9-10]。尤其是對胚胎進行反復凍融，可能對胚胎產(chǎn)生損傷的幾率更大，影響移植的種植潛能及移植后的臨床結局。

目前已有的對胚胎反復凍融的研究樣本主要是在不同發(fā)育階段進行冷凍，如殷寶莉等[11]分析了玻璃化冷凍復蘇的第3天卵裂期胚胎培養(yǎng)至囊胚后再行二次凍融移植，結果顯示二次凍融囊胚周期與單次凍融囊胚周期相比，臨床妊娠率顯著下降，據(jù)此認為多次凍融可能影響胚胎發(fā)育潛能。2006年Sheehan等[12]采用冷凍環(huán)(cryoloop)法對小鼠胚胎在2細胞期、4細胞期、8細胞期、囊胚期冷凍，研究結果表明，玻璃化操作并不影響小鼠胚胎發(fā)育形成8細胞期及囊胚期，甚至對移植后的種植潛能和新生鼠仔的體重無顯著性差異。與上述不同，本研究關注的患者是同一階段(卵裂期或囊胚期)連續(xù)二次凍融，中間幾乎未曾經(jīng)歷長時間體外培養(yǎng)發(fā)育的過程。為了探討這種連續(xù)二次凍融對胚胎種植及移植后臨床結局的影響，本文對2013年1月至2017年9月經(jīng)歷重復冷凍解凍的57個周期(39個囊胚解凍周期和18個卵裂期胚胎解凍周期)進行回顧性分析。結果表明，復蘇重復玻璃化卵裂期胚胎57枚，復蘇存活率為96.49%；解凍重復玻璃化囊胚24枚，存活率為95.83%。與目前報道的玻璃化冷凍方法的復蘇存活率大致相當[13]，鑒于本中心一般僅冷凍優(yōu)質胚胎，而優(yōu)質胚胎本身玻璃化冷凍的效果良好[14]，因此，對于經(jīng)歷一次凍融的胚胎再行重復凍融在技術上是可行的。

為了進一步探討重復凍融胚胎的種植潛能和移植后的臨床結局，我們從上述解凍周期中去除混合移植的周期數(shù)，最終收集了24個完全移植重復玻璃化凍融卵裂期胚胎和13個完全移植重復玻璃化凍融囊胚周期，同時相應的以同時期條件相當?shù)囊浦矄未蝺鋈谂咛ト巳鹤鳛閷φ铡７治鲞^程中，為了保證兩組樣本量以及基礎資料的均衡，本研究引入了傾向性評分匹配法[15]，傾向性評分法相當于一個事后隨機化的過程，其優(yōu)勢在于能夠將不同組間傾向性評分相近的個體匹配出來，均衡組間混雜因素的分布，減少處理效應估計的偏倚[16]。我們采用1∶3最近鄰匹配法、設定卡鉗值為0.03，匹配了女性患者年齡、移植胚胎數(shù)、移植優(yōu)質胚胎數(shù)3個影響臨床妊娠結局的關鍵因素后[17-18]，得到兩組間協(xié)變量相對均衡的對照組樣本，從而使分析的結果盡可能的真實和可靠[19]。

本研究的分析結果顯示，無論在卵裂期胚胎移植周期中還是在囊胚移植周期中，實驗組與對照組相比各項指標均呈現(xiàn)相類似的變化趨勢，即實驗組胚胎移植后種植率、HCG陽性率、臨床妊娠率、異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、活胎分娩率等臨床結局與對照組的單次冷凍解凍胚胎移植后的結局無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，也提示在患者年齡、平均移植胚胎數(shù)、平均移植優(yōu)質胚胎數(shù)平衡的條件下，重復玻璃化凍融對胚胎的種植及移植后臨床結局并無顯著影響。2011年Schlenker等[20]對染色體篩查(comprehensive chromosome screening，CCS)患者囊胚移植結果的研究也表明，經(jīng)歷玻璃化凍融-活檢-玻璃化凍融-移植之后種植率與單次凍融的整倍體囊胚移植結局相當(62.2%vs.63.6%)，移植后的臨床妊娠率為76.2%(16/21)。雖然本研究中的種植率和臨床妊娠率，都明顯低于Schlenker等[20]的研究，這主要是由于其數(shù)據(jù)來源于篩選后的整倍體囊胚的移植結局。但是，兩個研究結果同樣都提示重復凍融胚胎移植后的種植率及臨床妊娠率與單次凍融胚胎無顯著差異，其原因一方面可能與玻璃化冷凍解凍技術的發(fā)展成熟有關，另一方面也與樣本中大多數(shù)重復凍融胚胎為優(yōu)質胚胎有關，優(yōu)質胚胎耐受降溫和復溫損傷能力相對較強[21]。當然，受收集樣本的局限，本研究結果仍需要更大樣本量的隨機對照實驗驗證。