響應面法優化忍冬器官中四種成分的超聲提取工藝

胡玉濤　李天雪　許天罡

摘要：采用響應面法優化鹽堿地栽培忍冬（Lonicera japonica Thunb.）器官綜合物中咖啡酸、綠原酸、木犀草苷、多糖4種成分同時超聲提取的最佳條件。以咖啡酸、綠原酸、木犀草苷、多糖4種成分總含量為響應值，通過Box-Behnken響應面法對提取時間、溫度、料液比、乙醇體積分數這4個主要因素進行考察。結果表明，最優提取條件為提取時間1 h，溫度75 ℃，料液比1∶40（g∶mL），乙醇體積分數為45%。應用超聲提取技術能夠在鹽堿地栽培的忍冬器官綜合物中同時獲得一定含量的綠原酸、多糖、咖啡酸、木犀草苷等產物，具有提取效率高、節約資源等優勢。

關鍵詞：忍冬（Lonicera japonica Thunb.）；響應面；咖啡酸；綠原酸；木犀草苷；多糖；超聲提取

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）09-0088-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.09.021

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Four Components from

Lonicera japonica Thunb. by Response Surface Method

HU Yu-tao1，LI Tian-xue1，XU Tian-gang2

（1.The Center for Drug Research & Development，Lianyungang College of Traditional Chinese Medicine of Jiangsu Province，Lianyungang 222007，Jiangsu，China；2.Zibo Wellcell Biotechnology Co.， Ltd.，Zibo 256302，Shandong，China）

Abstract： An ultrasonic-assisted extraction method was established to simultaneously produce the chlorogenic acid，cafferic acid，luteoloside and polysaccharose from Lonicera japonica Thunb. in saline-alkali land. Using the total concentration chlorogenic acid，cafferic acid，luteoloside and polysaccharose of as response value，Box-Behnken response surface design was adopted to investigate the four main factors of extraction time，temperature，solid/liquid ratio and ethanol concentration. The results showed that the optimization conditions for extraction were extraction time 1 h，temperature 75 ℃，and solid/liquid ratio 1∶40（g∶mL） and ethanol concentration 45%. The ultrasonic-assisted extraction of the four components has the advantage of accelerating the extraction process and better products with lower cost.

Key words： Lonicera japonica Thunb.；response surface method；chlorogenic acid；cafferic acid；luteoloside；polysaccharose；ultrasonic-assisted extraction

忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的花蕾入藥，具有清熱解毒、涼風散熱、抗病毒、保肝利膽的作用[1，2]。莖藤入藥，具有清熱解毒、通絡的作用。忍冬的花及其莖、葉等器官富含揮發油、有機酸、黃酮、三萜、多糖等多種活性成分[3，4]。忍冬器官中的綠原酸、咖啡酸、多糖、木犀草苷等成分具有抗菌、抗病毒、免疫調節、抗腫瘤、抗輻射、延緩衰老及抗感染等多種作用[5]。忍冬作為藥食同源植物，在醫藥、食品、動物養殖等領域具有良好的應用前景。本研究采用Box-Behnken響應面法進行工藝優化[6]，分析了提取時間、溫度、料液比、乙醇體積分數4種變量因素對鹽堿地栽培忍冬器官綜合物中咖啡酸、綠原酸、木犀草苷和多糖總量的影響，以期獲取最優的提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

材料：忍冬器官綜合物，為2017年5月下旬采自連云港市青口金銀花種植基地，土壤pH為8.16，含鹽量為0.33%，單位器官綜合物中花、莖、葉的平均含量分別為5.4%、41.4%和53.2%。

試劑：綠原酸、咖啡酸、木犀草苷均由南京澤朗生物科技有限公司提供，2種對照品經HPLC峰面積歸一化法檢測質量分數均在98%以上；甲醇、乙腈為色譜純（Merk公司）；去離子水經過Milli-Q系統純化制備；其余試劑均為分析純，購自國藥集團。

儀器：1290HPLC型高效液相色譜儀（安捷倫公司），配有四元低壓梯度泵；AB135-S型十萬分之一電子分析天平（Mettler Toledo公司）；UV-1800型紫外-可見光分光光度計（日本島津制作所）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備 精密稱取對照品各10 mg，單獨以甲醇溶解并定容，制成質量濃度分別為1.0 mg/mL的對照品儲備液；分別精密量取適量儲備液混合置于容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，制得系列混合對照品溶液：1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、100.0、500.0 μg/mL綠原酸，0.2、0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL咖啡酸，0.10、0.25、0.50、1.00、5.00、20.00、50.00 μg/mL木犀草苷，避光保存。

1.2.2 色譜條件及方法學考察 色譜柱為Zorbox SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.2%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～6 min，10%乙腈；6～15 min，10%～30%乙腈；15～30 min，30%～60%乙腈；30～40 min，60%～100%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長327 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。以忍冬提取物濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸分析。

1.2.3 多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定忍冬提取物中總糖含量[7，8]。以葡萄糖為標準樣品，分別取標準溶液（質量濃度為0.8 mg/mL）0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL依次加去離子水補至2 mL，另取去離子水2 mL作空白試驗。每支試管加6%苯酚溶液1 mL，搖勻，然后每支試管中緩慢加入濃硫酸5 mL，搖勻并放入冷水中冷卻。在490 nm下比色測定，以葡萄糖質量濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標，制作標準曲線，得到方程為A=0.126 3C+0.008，R2=0.996 1。

1.2.4 工藝流程 采摘的忍冬器官綜合物自然干燥后，粉碎過篩，精密稱取20 g，超聲提取兩次，兩次提取液合并后離心得到上清液。一份上清液測定咖啡酸、綠原酸和木犀草苷含量；另一份上清液加入無水乙醇使最終醇體積分數達到95%后于常溫沉淀2.5 h，沉淀干燥后得到忍冬粗多糖，將上述干燥的粗多糖緩慢用去離子水溶解，并將此多糖溶液通過已活化的D101大孔樹脂柱去除小極性雜質，流速8 mL/min，洗脫使用3倍柱體積的去離子水，流速10 mL/min，將此多糖洗脫溶液冷凍干燥后于4 ℃保存待用。

1.3 Box-Behnken響應面法

根據預試驗結果，選擇顯著影響咖啡酸、綠原酸、木犀草苷和多糖總含量的4個因素，即提取時間（X1，min），溫度（X2，℃），料液比（X3）和乙醇體積分數（X4，%），以產物咖啡酸、綠原酸、木犀草苷和多糖總含量（Y，%）為響應值，采用Box-Behnken響應面法設計試驗方案，其他操作條件同“1.2.4”，共設計29組試驗。

2 結果與分析

2.1 忍冬3種化合物色譜分析

以化合物濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸分析，分別得到綠原酸、咖啡酸和木犀草苷回歸方程為y=8 604x-27 048（r=0.999 5）、y=3 349.5x-18 397（r=0.999 6）和y=57 785x-2 044（r=0.999 6），表明各化合物在范圍內線性關系良好。按照方法學相關要求進行操作，結果表明，專屬性中供試品3種待測成分色譜峰的分離度均大于1.5，其他雜質峰及空白對照溶液對待測成分均無干擾，方法專屬性良好（圖1）。在重復性試驗中（n=6），綠原酸、咖啡酸和木犀草苷峰面積的RSD分別為2.2%、1.7%和1.3%，在穩定性試驗中（n=6）3種化合物峰面積RSD均小于1.4%，在精密度試驗中（n=6），3種化合物峰面積RSD均小于0.9%，表明重復性、穩定性和精密度均良好；加樣回收率為98.2%～103.7%（RSD=2.4，n=5），表明準確度較好。

2.2 響應面試驗

Box-Behnken響應面設計與結果見表1。利用Design Expert 7.1.3軟件對表1中的數據進行二次多元回歸擬合并對回歸模型進行方差分析，結果見表2。

由表2可以看出，模型方程的F值是16.33，且P=0.000 1<0.01，說明模型方程極顯著，該試驗方法可靠。模型方程失擬項的P=0.116 8>0.05，為不顯著，表明未知因素對試驗結果干擾很小。試驗值與模型方程預測值的校正決定系數為0.961 6，表明該模型能解釋96.16%響應值隨響應因素的變化，模型擬合程度較好。對方程中各項進行顯著性分析，一次項、平方項和交互作用項的P均小于0.05，說明這4個因素以及因素之間的相互作用對響應值的影響都是顯著的，其中乙醇體積分數和4個有效成分的總產量的相互作用極顯著（P<0.000 1）。因此，所得模型方程能夠很好地預測產物總量隨各響應因素的變化。

通過軟件繪制出能夠反映影響產物總量的4 個因素交互作用的三維響應面圖，結果見圖2。由圖2可知，若等高線圖呈橢圓形則表明兩個因素交互作用顯著，若呈圓形則表明交互作用不顯著[9-11]。乙醇體積分數X4和另外3個因素呈橢圓形的等高線圖，表明乙醇體積分數的作用顯著。

利用軟件中的優化模塊得到最優組合，即提取時間為1 h，溫度為75 ℃，料液比1∶40（g∶mL），乙醇體積分數為45%。相應總產量的模型預測值為13.05%。在最優條件下進行驗證試驗，操作同“1.2.4”項下，測得提取物中咖啡酸、綠原酸、木犀草苷和多糖總含量為12.98%（RSD=2.06%，n=3），其中咖啡酸含量0.91%、綠原酸含量5.0%、木犀草苷含量0.05%、多糖含量7.02%，表明響應面設計得到的工藝條件是有效、可行的。

3 討論

應用超聲技術同時提取忍冬器官綜合物中多種成分，具有提取效率高、節約資源等優勢，合適的水醇比是其關鍵因素。隨著乙醇體積分數逐漸升高，產物的總量呈先增加后降低的趨勢。綠原酸、咖啡酸和木犀草苷在乙醇中的溶解度強于在純水中，乙醇體積分數上升使得3種化合物的提取率上升，而金銀花多糖溶于水，難溶于有機溶劑，乙醇體積分數太高，則會導致多糖沉淀。經優化應用45%的乙醇提取，綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和多糖的綜合提取率最佳。在含量檢測過程中以甲醇為系統各成分的分離效果并不理想，乙腈的黏度小，洗脫力大，經優化后的乙腈-甲酸水系統各成分的分離效果較好。應用超聲提取技術能夠在鹽堿地栽培的忍冬器官綜合物中同時獲得一定含量的咖啡酸、綠原酸、木犀草苷、多糖等產物，而以器官綜合物為收獲目標則更易于實施機械化采收，這將為實現忍冬的工廠化生產及其天然產物的深度開發提供參考。

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