土壤有機質分解的溫度敏感性：培養與測定模式

何念鵬,劉　遠,徐　麗,溫學發,于貴瑞,孫曉敏

1 中國科學院地理科學與資源研究所生態系統網絡觀測與模擬重點實驗室,北京　100101 2 中國科學院大學資源與環境學院, 北京　100049

1　土壤有機質分解及其對溫度變化的響應

土壤有機質是陸地生態系統最大的碳庫,儲存了約1500 Pg有機碳(1 Pg=1015g)[1]。土壤有機質分解所釋放的CO2是陸地生態系統與大氣間最大的氣體交換通量之一(60 Pg C a-1),約為化石燃料燃燒的10倍[2]。大量研究表明：土壤有機質分解速率(R或土壤呼吸速率)與環境溫度關系非常密切；在未超過土壤微生物活性最適溫度的情況下,R與溫度整體呈正相關關系,并可用直線方程、指數方程或冪函數方程等來描述[3]。土壤有機質分解速率及其對溫度的響應,長期以來一直是生態學和土壤學研究的核心問題之一。在全球變暖背景下,土壤有機質分解對溫度變化的響應很大程度影響著陸地生態系統對全球氣候變化反饋效應,成為近二十年研究的熱點[4-5]。目前,世界各地的科學家,采用室內培養、野外控制實驗、模型模擬等多種途徑,揭示土壤有機質分解對溫度變化的響應。受篇幅的限制,本文主要聚焦在土壤有機質分解的室內培養方法與測定模式。

2　土壤有機質分解溫度敏感性的定義、理論基礎與主要計算方法

2.1　土壤溫度敏感性定義及其重要性

土壤有機質分解速率(R)對溫度變化的響應非常敏感。長期以來,科學家廣泛地采用指數方程描述溫度對有機質分解的影響,并形成了簡單的經驗模型,這些模型都主要是從Hoff和Lehfeldt[6]提出的化學反應的溫度指數模型中派生而來。在具體操作上,科研人員采用溫度敏感性參數(Temperature sensitivity,Q10)來刻畫土壤有機質分解對溫度變化的響應程度[3,7-8]。通常,Q10是指溫度每升高10 ℃狀況下,R所增加的倍數；Q10值越大,表明土壤有機質分解對溫度變化就越敏感。Q10不僅取決于有機質分子的固有動力學屬性,也受到環境條件的限制。

Q10能抽象地描述土壤有機質分解對溫度變化的響應,在不同生態類型系統、不同研究間架起了一個規范的和可比較的參數。因此,Q10一經提出就廣受關注,并成為過去幾十年土壤學和生態學研究的核心內容之一?？茖W家圍繞Q10時空變異和影響機制等開展了大量研究工作[3-4],Q10也成為了絕大多數機理模型的重要參數。然而,由于不同傳統培養模式與測試方法的可比性較弱,科學家在短期內難以給機理模型(尤其是大尺度模型)提供一套兼顧時空變異特征的Q10參數,許多模型仍是依據土壤酶動力學特征推導而將Q10設定為2.0或1.5[9-10]。根據IPCC第五次評估報告,過去130年全球氣溫升高約0.85 ℃,并且全球氣溫升高的趨勢仍會繼續[5]。因此,氣候變暖如何影響土壤有機質分解,以及陸地生態系統如何響應氣候變暖就倍受關注。鑒于科學家已經對Q10影響因素、控制機制和區域變異等進行了多方面的綜述[3-4],本文重點探討室內培養與測試方法對Q10的影響。

2.2　Q10時空變異與影響機制研究中的重要理論基礎

為了更好地理解培養模式和測試方法的影響,首先回顧一下在Q10時空變異與影響機制研究的理論基礎；其中,兩個非常重要的理論基礎是Arrhenius方程和Michaelis-Menten方程。

(1)Arrhenius方程

早期,人們采用從經典化學反應中衍生出來的指數方程來描述土壤有機質分解與溫度變化之間的關系,但后來Arrhenius指出即使放熱的化學反應,也需要一點“推力”來促使反應發生,這個“推力”叫做“活化能”。因此,Arrhenius[11]于1889年根據動力學原理發展了Arrhenius方程:

(1)

式中,k是反應速率常數,A是擬合參數,Ea是反應所需要的活化能(J-1mol-1),R是氣體常數(8.314 K-1mol-1),T是開氏溫度[3]。

Arrhenius方程的內涵: 具有復雜分子特性的有機質(如：難分解有機質、復雜有機質,以及礦物吸附有機質)具有較低的分解速率,分解過程需要更高的活化能,因此具有更大的Q10值。換句話說：隨著溫度增加,具有足夠能量參與反應的分子增加相對減少,導致溫度敏感性降低[3]。此外,Arrhenius方程表明溫度敏感性隨著有機質穩定性的增加而增加,因為穩定的底物需要更高的活化能而變得不活躍。這也意味著穩定的碳庫比易分解的碳庫對溫度變化更加敏感。

Arrhenius方程的局限性：雖然Arrhenius方程在許多研究中都被應用或證明,但是只有在底物有效性不受限制的條件下最為適用,此時獲得的溫度敏感性被稱為土壤的固有溫度敏感性[3]。然而,土壤有機質分解還經常受到土壤水分和底物有效性等因素的影響,當土壤底物有效性較低或底物嚴重受限制的條件下,Arrhenius方程不再適用,此時的溫度敏感性被稱為表觀溫度敏感性[3]；隨著研究的深入,科研人員提出米氏方程(Michaelis-Menten equation)來補充解釋該現象。

(2)Michaelis-Menten方程

RS=Vmax×[S]/(Km+[S])

(2)

式中,[S]是底物有效性,也是在酶活性位點處的底物濃度；Vmax是給定溫度下的最大反應速率；Km是米氏常數[11],代表酶與底物的親和能力,用最大速率一半(Vmax/2)時的底物濃度表示,也是反映溫度敏感性的重要參數[12-13]。

米氏方程的理論基礎：Km和Vmax均是對溫度變化敏感的參數,當底物濃度[S]充足,并且溫度沒有超過酶活性的最適溫度時,Km對反應的影響不重要,這時Vmax對溫度的響應決定了反應速率的溫度敏感性。這一過程只取決于基于Arrhenius方程的酶催化作用。Vmax隨著溫度升高逐漸升高。然而,當底物有效性較低時(當S與Km大致相當或遠低于Km),Km成為一個重要影響因子,這時分解速率取決于酶和底物的濃度。由于Km和Vmax均隨著溫度升高而增加,因此Km和Vmax的溫度敏感性會相互抵消[3]。這種“抵消作用”在底物濃度很低的時候尤為明顯。Michaelis-Menten方程可以更好地解釋外來物質輸入或底物消耗情景下的Q10變化。

2.3　Q10主要計算方法

Q10計算方法主要有以下幾種：

(1)指數方程推算法

經驗模型認為土壤有機質分解速率隨溫度增加呈指數上升。

RS=A×ebT

(3)

Q10=e10b

(4)

式中,RS是土壤有機質分解速率,A是指數方程擬合參數,b是溫度敏感性系數,T是培養溫度。

(2)直接定義法

根據Q10定義,在相同的培養時間計算不同培養溫度下土壤有機質分解速率的比值。

(5)

式中,T1和T2是培養溫度,R1和R2分別是溫度T1和T2下土壤有機質的分解速率。

(3)等碳庫法

在長期培養條件下,高溫會促進土壤快速分解,底物消耗較大；因此,在相同培養時間下,不同培養溫度下的底物質量存在較大差異。為了克服等時間方法造成的底物消耗問題,Conant等[14]提出利用不同培養溫度下分解相同比例的碳所用時間的比值來表示Q10。

(6)

式中,T1和T2是培養溫度,t1和t2分別是在溫度T1和T2下分解相同土壤有機碳所需要的時間。該方法有兩個重要的前提假設：1)在不同培養溫度下,參與反應的微生物類群理論上是相同的；2)在不同培養溫度下,參與分解的有機質組分的化學特性在時間序列上都是從易分解到難分解。

(4)模型方法

利用一階動力學的單庫或多庫模型擬合土壤有機質分解累積曲線,得到擬合的溫度敏感性參數k,然后根據公式7計算Q10[15]。

(7)

式中,Ccum是累積分解釋放的CO2量,C0是土壤初始有機碳含量,t是培養時間,Q10和k是模型擬合的參數,T1和T2是培養溫度。

3　Q10研究的傳統室內培養與測試模式及其優缺點

科研人員以土壤有機質分解對溫度變化的響應特征、Q10計算方法和基本理論為基礎,設計并發展了一系列經典的室內培養與測試模式,并被廣泛應用。

3.1　恒溫培養+間斷測定模式(模式A)

圖1　土壤有機質溫度敏感性研究的3種主要培養與測試模式Fig.1　Three models of incubation and measurement modes for the studies of the temperature sensitivity of soil organic matter (SOM) decomposition

室內培養實驗中,傳統的Q10研究大多采用了恒溫培養+間斷測試模式[4,14](圖1A)。例如,Conant等采用這種模式測定了不同土地利用方式下土壤有機質的溫度敏感性的變化,結果發現溫度敏感性與土壤有機質質量密切相關[4]。通常,根據不同實驗目的或實驗室條件,研究人員先設置3—6個恒定溫度對土壤進行培養(如5、10、15、20、25、30 ℃等),然后在天、周、月間隔,測定RS；在測試方法上,大多采用堿液吸收法或氣相色譜法進行測定,然后再利用所測定的RS和對應溫度計算Q10。該模式最大優點是操作簡單、對儀器要求不高,幾乎所有實驗室均具備該模式所需條件。

然而,從理論和實踐角度來看,模式A存在明顯缺陷,一定程度上會影響實驗結論的準確性和可靠性。具體概括如下：1)在恒定溫度下培養,土壤微生物可能會對特定溫度產生適應性,從而對實驗結果產生影響。研究發現,在不同恒定溫度培養下,土壤微生物的結構和功能具有明顯的分化和差異[16]。2)恒定培養溫度會導致不同處理樣品間的底物消耗不一致,尤其是高溫vs.低溫和短期vs.長期,可通過改變底物有效性而對實驗結果產生明顯影響。例如,將土壤樣品分別在5、15、25 ℃培養一段時間,25℃培養會導致土壤樣品中易分解組分的快速消耗,甚至引起活性底物供應不足；由于長期高溫培養時會導致土壤底物消耗很大,從而低估Q10。3)由于模式A方法本身的限制,使得大多數研究只能采用較少的溫度系列(3—5個),導致用于計算Q10的不同溫度的數據偏少。由于計算過程中大多是采用曲線擬合,較少的溫度處理水平會影響Q10擬合精度。4)模式A測試過程比較費時費力,難以同時或對大批樣品進行測試。

3.2　漸近式變溫培養+間斷測定模式(模式B)

為了彌補模式A的不足,特別是克服模式A從方法及機理上難以準確估算Q10的問題,近年來科研人員發展了漸進式變溫培養+間斷測定模式[8](圖1B)。例如,Fang等采用這種漸近式變溫培養模式研究了不同有機質組分溫度敏感性的差異,發現易分解有機質和難分解有機質對溫度變化具有相同的敏感性[8]。另外,Ding等也采用該方式研究了不同高寒草地生態系統土壤有機質分解溫度敏感性的區域變異及其控制機制[17]。簡單而言,該模式對同一批土壤樣品采用逐漸升溫,然后再降溫的培養方式,同時配套低頻度的間斷測定模式測定土壤有機質分解速率。首先,將土壤樣品在適宜的溫度下培養3—7 d,實現土壤樣品活化并防止脈沖式效應對實驗結果的干擾。隨后,采用氣象色譜或者CO2紅外氣體分析儀的方法測定土壤樣品的分解速率,在完成特定溫度的測試任務后,將培養溫度升高到預先設定的溫度,并在土壤樣品適應和穩定一段時間后,測定該溫度狀況下的土壤有機質分解速率；依序升溫直到預定的最高溫度,隨后再采用逆向降溫模式進行隨后的培養與測試[17-19]。

該模式較好地克服了模式A的前兩個缺陷,即土壤微生物對恒定培養溫度的適應性以及不同培養溫度底物消耗不均的缺點,是對傳統方法學的重要改進。然而,在實際操作過程中,模式B仍然存在一些問題：1)該方法更適用于短期的培養實驗,難以開展長期測試。例如,對同一批樣品,我們很難準確確定底物消耗成為限制性條件時的培養時間,我們只能憑借經驗假設短期內(如1—7d)不會出現底物供應受限；因此,模式B難以適用于底物貧瘠或長期培養樣品。2)在測定方法上,模式B依然采用傳統氣相色譜法(CO2紅外分析法)的手動測試模式；同時,由于這種變溫過程較為繁瑣,導致一般溫度處理系列約為4—6個,難以克服因數據量不足而引起的Q10誤差。3)變溫培養及測試過程較為繁瑣、費時費力,難以同時對大量樣品進行測試。

4　Q10研究的新一代培養與測試模式(模式C)

毋庸置疑,近年來有關Q10研究的蓬勃發展,模式A和模式B起到了非常大的推動作用。如第3節中的討論,它們在理論和操作上仍然存在缺陷,有待進一步改進。因此,改進和發展新Q10的培養和測試模式,不僅有助于推動Q10研究朝著精準化方向發展,還有助于拓展和深化Q10的機理研究。

在Cheng和Virginia[20]和He等[21]研究的基礎上,我們發展了連續變溫培養結合連續-高頻土壤微生物呼吸速率的測定裝置與技術,催生了Q10研究的連續變溫培養+連續自動測試的新模式(圖1, 模式C)[22-25]。模式C充分利用連續變溫培養+連續-高頻土壤微生物呼吸測定裝置聯用的優勢,實現了對土壤樣品連續變溫培養,基本克服了恒溫培養模式(模式A)土壤微生物對特定培養溫度的適應性和底物消耗不均的重要缺陷。模式C通過開發連續-高頻土壤微生物呼吸測定系統,可結合培養過程的溫度特征,在升/降溫過程中對每個樣品進行連續的、高頻度的測試(2—20min/次),通過測定更多溫度下土壤微生物呼吸速率來提高Q10的擬合精度。同時,模式的培養與測試過程非常簡單快捷,有利于開展大量樣品測試或大尺度聯網研究。然而,模式C對實驗設備投入要求較高,亟需開發成套的商業設備來推動其廣泛的應用。目前,基于He等[21]原型機的基礎上,已經開發了商業化的定型產品并公開銷售(Pri- 8800, 原生態有限公司, 北京),為大面積推廣模式C提供了設備和技術保障。通過上述分析,不論是從基本理論還是操作角度,模式C均優于模式A和B,具有非常廣泛的應用前景。

5　連續變溫培養+連續自動測試模式的應用前景展望

連續變溫培養+連續自動測試模式(模式C)基本克服了傳統的Q10研究的主要缺陷(注：它仍然無法解決室內培養與野外狀況的差異,但該問題不屬于本文討論范疇),并具有連續變溫培養+連續自動測試的特點,具備自動、連續、快速的特點。首先,模式C能為大多數實驗室提供一種快速測試土壤微生物呼吸速率的通用途徑和設備,可替代傳統的堿液吸收法和氣相色譜法[26- 27]。

此外,模式C也能在如下方面開展一系列創新性研究：1)利用其自動、連續、快速的特點,開展區域尺度的聯網研究,揭示不同區域或植被類型的Q10變異及其控制機制[25]。受傳統培養和測試方法的影響,研究人員很難開展類似的研究,雖然整合分析能一定程度解決這個問題,但也存在不同實驗處理條件和實驗測定方法造成的高不確定性問題。2)開展Q10對連續溫度變化過程響應研究,更真實的模擬溫度變化情況,從而揭示土壤微生物呼吸對溫度變化的響應機制[24]。受傳統方法的限制,當前大多數研究均在小時、天、周尺度來開展,并沒有揭示真實的溫度日動態。3)更好地開展土壤微生物對水分或資源快速變化情景下的研究[23]。例如,降水脈沖是干旱-半干旱區的常見現象,土壤微生物活性(碳礦化速率或氮礦化速率)對水分可獲得性的響應一直是非常重要又極具挑戰性的科學問題；類似的,土壤微生物對外界資源脈沖式供應的響應或激發效應也是近期研究熱點。隨著模式C的廣泛使用與進一步改進,尤其是與13C分析設備相結合,相信會具有更多的應用前景。

6　結論

本文結合Q10定義、基本理論和計算方法,探討了當前有關Q10研究培養和測定模式的優缺點；尤其是結合最近新發展的連續變溫培養+連續自動測試模式,前瞻性地提出了一系列應用前景。此外,本文希望能呼吁更多國內年輕科研人員對基本方法、設備改進的重視,更好更快地推動原創性研究。