珍稀瀕危植物距瓣尾囊草(Urophysa rochkii)的開花物候和繁育系統特性

別鵬飛,唐　婷,胡進耀,,*,蔣　煒

1 綿陽師范學院,生命科學與技術學院,生態安全與保護四川省重點實驗室,綿陽　621000 2 綿陽市蜀創農業科技有限公司,綿陽　621000

距瓣尾囊草(Urophysarochkii)屬于毛茛科(Ranunculaceae)尾囊草屬(UrophysaUlbr)植物。世界上尾囊草屬的植物僅有兩種,分別是尾囊草和距瓣尾囊草,全部自然分布在我國境內,而距瓣尾囊草僅在江油市涪江上游區段有少量分布[1-2]。同時該物種富含芳香類油脂,花瓣和葉片顏色隨時間不斷變化,花期很長(一般為頭年12月至次年4月),且是冬季開花植物,因此具有潛在的藥用價值和園林觀賞價值[3- 5]。

胡進耀等對江油武都水庫距瓣尾囊草的生長環境、播種和移栽實驗、群落土壤理化特征和生物學特性進行研究,結果表明原生土最適宜其種子萌發和生長[4- 6]。張云香對距瓣尾囊草進行了種子散布及萌發特性研究[7],結果表明距瓣尾囊草對環境依賴性強的生殖過程以及種群生殖能力低下是其處于瀕危狀態的主要原因之一。王金錫[8-9]、劉彬[10]等對其進行了相關的文獻考證及生物學特性、生態學特性與群落分析,蘇澤源等根據以上研究總結提出了關于距瓣尾囊草“搶救性遷地移植保護方案”[11]。以上研究為進一步對距瓣尾囊草的研究提供了極有價值的資料,但這些研究限于群落特征等方面的研究。距瓣尾囊草目前野外僅有2026株存活,其中本實驗點向家溝種群約有322株,占15.89%[8]。要保護該極小種群物種,首先要厘清其生殖生態學特性,了解其生殖能力低下的原因。

繁育系統是指代表所有影響后代遺傳組成的有性特征的總和,主要包括花形態特征、花的開放式樣、花各部位的壽命、傳粉者種類和頻率、自交親和程度和交配系統,其中交配系統是核心[12]。植物開花的時間分布、繁育系統與花部特征對其生殖成功與否起決定性作用[13-15],同時也影響植物的遺傳多樣性及其分布格局[16]。瀕危植物在片斷化生境中,每個小的居群中由于遺傳多樣性的喪失等原因,使其具有很高的滅絕風險[17-18]。而繁育系統又是影響植物居群遺傳多樣性的最關鍵的生物學因素之一,對植物的花部特征與繁育系統特性的深入研究對瀕危植物的保護及開發利用具有指導作用[19-20]。因此,要保護該極小種群物種,首先要解決的科學問題是研究清楚該物種的開花物候和繁育系統。以期從生殖生態學角度探索其可能存在的瀕危原因。為保護和利用該物種提供科學依據。

1　研究區概況與方法

1.1　研究區概況

距瓣尾囊草對環境要求較高,現僅發現4個小種群。本實驗選擇江油地區的永勝鎮向家溝作為試驗點(圖1),其地理位置31°59′14.6″N、104°51′01.8″ E,坡度85°,坡向北偏西20°,海拔910—970 m。該地區屬亞熱帶季風氣候區,具有冬暖春早、夏長秋短、無霜期長、雨量充沛、四季分明、雨熱同季、地域變化明顯的氣候特點。生長區域平均年降水量1143.2 mm。

距瓣尾囊草生長在山中部石灰質崖壁較濕潤處,伴生植物主要由鐵線蕨(Adiantumcapillusveneris)、報春花(Primulamalacoides)、淫羊藿(EpimediumdavidiiFranch)等,距瓣尾囊草種群呈集聚型分布。

1.2　方法

1.2.1開花物候及花部綜合特征

在2011年和2012年的花蕾期,在不同種群中隨機選取50株距瓣尾囊草植株進行標記,每株1個花序。為了觀察單花花期,每2—3天觀察1次花蕾,直至花朵開放。花朵開放后,每1天觀察1次,直至花朵脫落或成為果實。每次觀測均注意記錄花朵開放、花粉散出、柱頭伸長等,并記錄花朵形狀、大小、顏色和它們的時空動態,尤其注意柱頭與花藥的位置。對該種群的花序進行連續觀察,記錄花在花序上的開花動態過程,空間排列狀況等,每天記錄當天開花的數目,凋落或結果的花朵數目,每天計算當天開花率,累積開花率。用下列公式表示花序內花朵開放百分率：

花序內花朵開放百分率=某一特定日期的開花數目/(開放花朵+未開放花蕾+凋落或結果的花朵)

另外按照Dafni和Maués[22]所述標準描述觀測地點距瓣尾囊草的種群開花進程并記錄其開始的時間：①開始開花；②25%以下的植株開花；③50%以上的植株開花；④25%以下的植株尚處于花期,余者已經凋謝；⑤開花末期(少于10%的植株仍在開花)。

1.2.2花粉活力的動態

8:30—18:30每隔3 h分別采集不同發育時期的新鮮花備用。參照Dafni[21]的實驗方法,采用TTC法測定(將新鮮花粉置于載玻片上,同時用火加熱致死的花粉作對照)花粉活力。將開花后不同時期的花粉撒在載玻片上,滴加1—2滴0.5%TTC溶液(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride),迅速蓋上蓋玻片,置入墊有濕潤濾紙的培養皿中,放在25℃黑暗條件下培養2 h左右。在顯微鏡下觀察,若花粉變紅則表明有活力,若紅色很淺或無變化或變黑色則表明無活性。統計全部花粉中紅色花粉所占比例(每片載玻片上的花粉數>500粒,重復5朵花)。以染色率表示花粉的活力百分率,即有活力花粉的比率=紅色花粉數/觀察花粉總數×100%。

1.2.3柱頭可授性的動態

采用聯苯胺-過氧化氫法測定距瓣尾囊草雌花的柱頭可授性[22],直到無活力為止。具體步驟為：(1)隨機標記開花前一天的花朵,開花后每天10:00—11:00從每株上各取新鮮花朵,去除花的各部分僅剩下雌蕊(柱頭)；(2)將其放入凹玻片的凹槽中并在解剖鏡下調整好視野；(3)加了聯苯胺-過氧化氫溶液(1%聯苯胺∶3%過氧化氫∶水=4∶11∶22,體積比)于凹槽中,并立即觀察；(4)若柱頭具有可授性,則柱頭表現過氧化物酶活性,其周圍發生反應,呈現藍色并伴有大量氣泡出現,此時認真觀察并記錄其活力情況；否則無氣泡產生且不變藍,對比確定自然條件下柱頭顏色的變化與柱頭可授性的相關規律。

1.2.4花粉-胚珠比(Pollen-ovule ratio, P/O)的估算

隨機摘取花蕾50朵(每株最多2朵)花藥尚未開裂固定于FAA,按照Pias和Guotian的方法[23]統計單花花粉粒粒數。將每朵花的子房置于載玻片上,在40倍解剖鏡下進行解剖,在載玻片上滴1滴蒸餾水,將子房置于其中。細心解剖將胚珠從胎座中解開,觀察并計數。依據Cruden[24]的標準,P/O為18.1—39.0時,繁育系統為專性自交；P/O為31.9—396.0時,繁育系統為兼性自交；P/O為244.7—2588.0時,繁育系統為兼性異交；P/O為2108.0—195525.0時,繁育系統為專性異交；P/O值的降低意味著近交程度的升高,P/O值的升高伴隨著遠交程度的上升。

1.2.5雜交系數(Out-crossing index, OCI)的估算

按照Dafni的標準進行花序直徑；花朵大小及開花行為測量及繁育系統的評判。具體方法：(1)花朵或花序直徑<1 mm記為0；1—2 mm記為1；2—6 mm記為2；>6 mm記為3。(2)花藥開裂時間與柱頭可授期之間的時間間隔,同時或雌蕊先熟記為0；雄蕊先熟記為1。(3)柱頭與花藥的空間位置,同一高度記為0；空間分離記為1。三者之和為OCI值。評判標準為,OCI=0時,繁育系統為閉花受精；OCI=1時,繁育系統為專性自交(Obligate autogamy)；OCI=2時,繁育系統為兼性自交(Facultative autogamy)；OCI=3時,繁育系統為自交親和有時需要傳粉者；OCI=4時,繁育系統為部分自交親和,異交,需要傳粉者。

隨機選擇50朵花,對距瓣尾囊草花的直徑以及開花后雌雄蕊時空分布的情況進行測量,計算出距瓣尾囊草的雜交指數,對照Dafni標準,結果作為其繁育系統的另一指標。

1.2.6繁育系統的鑒定

在野外對花進行下述7種處理：(1)對照組,不套袋、不去雄、自由傳粉,用于檢測自然條件下的傳粉情況。(2)自發的自花傳粉,開花前套硫酸紙袋,不去雄,檢測是否存在自交。(3)同株異花傳粉,去雄套硫酸紙袋,同株異花之間人工授粉,檢測是否存在同株異花式自交及是否親和(檢測能否受精結實)。(4)異株異花授粉,去雄、用不同植株相同類型的花粉進行人工授粉,然后套袋,檢測雜交是否親和。(5)自然條件下的異花授粉,去雄不套袋，自由傳粉,與前面4項的結果比較,檢測座果狀況是否受采粉者限制以及各種授粉方式所占的比例。(6)去雄、套網袋,檢測風媒傳粉的效果。(7)去雄和去雌套硫酸紙袋不授粉,檢測是否有無融合生殖現象。

1.2.7數據統計與分析

采用SPSS 19.0統計軟件檢驗變量之間是否存在差異,并用Excel軟件進行繪圖。

2　結果

2.1　開花物候與開花進程

根據2011年和2012年野外實驗觀察發現,距瓣尾囊草為夏枯型植物。8月上旬距瓣尾囊草開始返青生長,10月初開始形成花芽,12月上旬花芽開始萌動并逐步膨大,這個過程持續時間較長,一般為1個月左右,然后經歷開花、凋謝,到花絕大部分凋謝時,開花物候結束(圖2)。

圖2　開花進程Fig.2　The flowering process

從種群第一朵花到最后一朵花凋謝即為種群的花期。從(表1)花的開花進程可以看出距瓣尾囊草整個種群的花期為120 d左右,隨著氣溫不斷升高,光照不斷加強,距瓣尾囊草一般在2月中下旬開花速度明顯加快,達到50%以上。

觀察結果表明,距瓣尾囊草單花開花無固定時間,單花開花持續時間7—15 d不等,以12 d出現的頻率最高(圖3),平均單花花期為(11.18±1.64)d。花蕾期花萼片常呈淡綠色或淡紫色,花序上的花朵為互生。花開放時,花萼片陸續張開,萼片顏色發生變化,由淡綠色變為白色或天藍色(淡紫色),同一花序上一般都是頂端的花朵最先開放。晴天花蕾多在中午前后開放,這可能與開花當天的氣溫有關。花開放時,柱頭明顯高于花藥的位置。花柱在花期伸長不明顯；而花絲在開花當天或第2天開始伸長,直至花藥開始裂開,花粉散出。所有花絲中內輪的花絲先伸長且其上的花藥首先散出花粉。單花期依其形態和散粉特征可分為4個時期：散粉前期—開花當天至花藥開裂前,花萼開裂,露出雄蕊群和雌蕊群,內輪花絲開始伸長；散粉初期—開花第4—6天,花萼片完全展開,內輪花絲伸長高于柱頭,5—7個花藥開裂；散粉盛期—開花第7—10天,大部分花藥開裂,柱頭彎曲；散粉末期—第11—15天,花藥全部開裂或枯死,且花藥中的花粉全部散出,花萼片開始凋落,柱頭變為淡紫色。

表1　距瓣尾囊草的開花進程(日/月/年)

圖3　單花開放持續時間頻率分布Fig.3　The frequency distribution of single flower longevity of Urophysa rochkii

2.2　花粉活力和柱頭可授性的動態特征

通過使用改良的TTC法測定不同散粉時間花粉的活力。距瓣尾囊草在花朵未開放前花粉沒有活力。花藥開裂后第1天花粉活力達到94.8%,第2天為90.3%,第3天為81.6%,以后花粉活力逐漸降低。研究結果表明,距瓣尾囊草在花藥開裂后的第4天,花粉活力降至62.9%,此后其花粉活力明顯減弱。

花藥散粉后2 d內,距瓣尾囊草的柱頭無可授性,柱頭成柱狀且柱頭的位置略高于雄蕊群,綠色。散粉第3天,柱頭展開并向花藥彎曲,此時雄蕊的位置高于柱頭,柱頭變為紫綠色,表現出一定的可授性。散粉第4—5天,柱頭可授性最強,柱頭彎曲程度增大且柱頭完全埋于雌蕊群中。此后,柱頭可授性逐漸減弱,直至散粉后的第8天,柱頭變成紫色,失去可授性(表2)。

表2　距瓣尾囊草的花粉活力、柱頭可授性及其形態特征

+表示柱頭具有可授性；++表示柱頭具有較強可授性；-表示花粉失活或柱頭不具可授性

2.3　花粉-胚珠比(Pollen-ovule ratio, P/O)

測量了20朵距瓣尾囊草的花,其單花花藥數、單花花粉量、單花胚珠數及花粉胚珠比如(表3)所示。

表3　距瓣尾囊草花粉胚珠比(P/O)統計

距瓣尾囊草花粉量每朵花平均為(42969.8±13604)粒,胚珠數每花平均為45.7±5.6,P/O值每花平均為938.5±250,按照Cruden的標準,距瓣尾囊草的有性繁育系統為兼性異交。

2.4　雜交系數(Out-crossing index, OCI)

測量得出,距瓣尾囊草花直徑為(19.26±2.80) mm,距瓣尾囊草具有明顯的雌雄蕊異熟現象。距瓣尾囊草花藥開裂時間與柱頭的可授期之間的時間間隔為雌蕊先熟,柱頭與花藥位置不在同一高度。按照Dafni的標準,距瓣尾囊草的OCI=4,即距瓣尾囊草的繁育系統為異交、部分自交親和、需要傳粉者(表4)。

表4　距瓣尾囊草雜交指數觀測結果

2.5　繁育系統

由圖4可以看出,自然對照的40個距瓣尾囊草花序結實率為78.94%,直接套袋結實率為5.71%；去雄套網袋的結實率為13.16%；去雄套袋和去雌套袋,均不結實；人工同株異花授粉的結實和人工異株異花授粉的結實率都比較高,達到80%以上,略高于自然結實率；自然條件下異花授粉(去雄不套袋)的結實率為67.5%遠高于去雄、套網袋的結實率。

對所得數據進行分析,研究結果表明：自然結實、去雄人工同株異花授粉、去雄人工異株異花授粉三者之間無顯著差異,都高于去雄不套袋，且四者都極顯著高于直接套袋處理和去雄套網袋處理的結實率(P<0.01)；而直接套袋處理和去雄套網袋處理的結實率都極顯著大于去雄套袋和去雌套袋(P<0.01)。

圖4　距瓣尾囊草7種不同處理方式的結實率(平均值±標準差)Fig.4　Mean (±SD) seed set of 7 different treatments of the Urophysa rochkii不同字母表示差異顯著 (P<0.05)

3　結論與討論

傳粉的成功依賴于較強活力的花粉與較高可受性柱頭的相遇,生境不同,花粉活力與柱頭可受性及二者的相遇期都會隨之而變化[25]。本文對距瓣尾囊草的開花物候、花粉活性、柱頭可授性以及繁育系統的鑒定做了初步研究,為下一步對其傳粉生態學研究以及探究距瓣尾囊草繁育系統特性與其瀕危原因之間的關系提供材料和依據。

開花物候是植物重要的生活史特征之一[26],也是植物生殖生態研究的一個重要內容[27-28],它主要研究植物開花式樣與非生物因子間的關系以及植物開花的遺傳基礎和自然選擇。探討其適應意義[26,29],可表現在群落、科、屬、種、種群、個體、花序和單花等多個水平上,植物個體或群體的開花物候可以用一系列參數如開花數、開花時間和開花持續時間等來量化,這些參數能顯著影響植物的生殖成功[30]。一些研究表明,開花物候不僅與植物類群的系統發生及遺傳特性有關[31],而且與環境條件有密切聯系[32- 34]。對距瓣尾囊草開花物候的觀察表明,距瓣尾囊草花期較長,花期一般從第一年的12月上旬開始,一直持續到第二年的4月中下旬。開花時間長,且表現出明顯的開花不同步性。這種開花持續時間長且開花不同步不僅可以保證植株在較長時間內都能成功完成傳粉受精過程而保證生殖成功,而且也可以降低花期惡劣的自然環境如倒春寒對其生殖成功造成的不良影響,這是距瓣尾囊草長期適應環境影響所形成的一種生殖策略。正如焦培培等對瀕危植物矮沙冬青開花物候的研究以及周正立等對瀕危植物胡楊、灰葉胡楊開花物候的研究也支持了這一觀點[35-36]。野外實驗觀察還發現,不同生長環境的距瓣尾囊草開花時間也不同步,一般生長在崖壁高處的開花時間都早于生長在崖壁下面的,這可能是由于光照時間和光照強度的不同,導致開花不同步。

植物花粉的活力與壽命因植物種及環境條件不同而有所差異：如海棗花粉可維持活性數月至一年；茄的花粉在夏季只能存活1 d,在冬季能維持3 d[37]；芍藥的花粉活力可持續半個月以上[38]；刺五加植株的花粉活力在開花之初較高,但3 d后迅速下降,4 d后大部分失去活力[25]。而柱頭可授期是花朵成熟過程中的一個重要時期,它能在很大程度上影響自花傳粉率、開花不同階段的傳粉成功率、各種傳粉者的相對重要性、雄性和雌性功能之間的相互干擾、不同基因型的花粉之間的競爭以及配子體選擇的機會等等[21]。不同植物的柱頭可授期所持續的時間從幾天到十幾天不等,花朵的年齡、一天內的不同時間段以及柱頭分泌物的有無等對其均有影響[28]。本文研究結果表明,距瓣尾囊草花粉活力較高時期與柱頭可授性較高的時期不一致,同一朵花的柱頭可授性較強期和花粉活力較高期基本沒有重疊,表明距瓣尾囊草存在雌雄異熟現象,進一步證明其傳粉機制是以異花傳粉為主,是避免自交的一種適應性機制。

自然界絕對自交或雜交的植物類群很少,大多是兩者兼而有之并采取混合交配的繁殖對策模式[39]。對繁育系統的多樣化及其作用模式和機制的研究,是理解植物各類群進化的一個重要基礎[40]。本實驗測定了距瓣尾囊草單花花粉胚珠比(P/O)為938.5±250,按照Cruden的花粉胚珠比(P/O)的標準劃分,距瓣尾囊草的有性繁育系統為兼性異交。按照Dafni的標準,距瓣尾囊草的雜交系數OCI=4,即距瓣尾囊草的繁育系統為異交、部分自交親和、需要傳粉者。

在不穩定的環境中植物會通過改變一些生態機制來保證生殖成功,比如植物常常會改變自身繁殖策略,包括植物對雌雄性資源投入的權衡[41-42]。而P/O值是衡量植物對雄性資源分配量的一個指標[43]。本研究表明距瓣尾囊草的單花花粉量較大,而胚珠相對較少,P/O值較高。這可能是由于距瓣尾囊草的生境特殊性因素限制了訪花昆蟲的活動,使訪花昆蟲的種類和數量減少,從而限制距瓣尾囊草的有效傳粉,但其雄性資源投入的增長,是其適應環境從而保證生殖成功的有效對策。

一般而言,自交不親和、雌雄異位和雌雄異熟被認為是促進異交、避免自交的重要機制[44- 46]。在異花傳粉者不足等選擇壓力下,一些物種能夠演化出自交親和或依賴自交的種群和個體[47- 49]。為了生存的需要,生物往往發展出一整套必要的生殖補償機制,保證物種繁衍的順利進行[50]。本研究結果表明：自然對照的結實率遠高于直接套袋結實率,說明距瓣尾囊草存在自交親和現象,可以自發傳粉；去雄、套網袋的結實率為13.16%,說明其存在風媒傳粉的方式；去雄套袋和去雌套袋均不結實,說明不存在無融合生殖現象；人工同株異花授粉和人工異株異花授粉的結實率都略高于自然結實率,說明其繁育系統以異花傳粉為主,可能存在傳粉限制或花粉干擾；自然條件下異花授粉(去雄、不套袋)的結實率遠高于去雄、套網袋的結實率,表明其在授粉過程中需要傳粉者,其結實率受到傳粉者的限制。以上結論還不能充分說明距瓣尾囊草的繁育系統特性是其致瀕原因之一,需要結合傳粉生態學等實驗進一步驗證說明。對于距瓣尾囊草混合型繁育系統,關于其權重比例及后代的生活力有待進一步研究。這種具兼性交配系統的現象在毛茛科其他植物,如獨葉草、頓裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)、小花草玉梅(Anemonerivularis)中葉存在[51]。

致謝：感謝江油市林業局蘇澤源高級工程師對實驗的幫助。