六種特級初榨橄欖油揮發(fā)性香氣成分的比較

劉少敏，何天鵬，薛丹丹，鄧海蓮，楊平，宋煥祿，王蓓，劉野

(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京，10048)

橄欖油是從新鮮油橄欖中冷榨提取而得到的一種高檔食用植物油，富含不飽和脂肪酸(油酸占55% ～ 83% )、多酚、角鯊烯以及維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗氧化、預(yù)防癌癥、預(yù)防心腦血管疾病、調(diào)節(jié)膽固醇和調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能等諸多作用[1]。因其豐富的營養(yǎng)成分和優(yōu)質(zhì)的口感，橄欖油深受人們青睞，在西方國家被譽(yù)為“液體黃金”、“地中海甘露”、“植物油皇后”等，享有極高的評價[2]。橄欖油的風(fēng)味在消費(fèi)者偏愛程度以及橄欖油質(zhì)量評價上舉足輕重，國際橄欖油理事會根據(jù)酸價、過氧化值、特定波長紫外吸收值( K232、K270) 及游離脂肪酸含量等參數(shù)并結(jié)合感官評分來鑒定橄欖油的等級。目前，國內(nèi)外測定橄欖油風(fēng)味的前處理方法主要有固相微萃取(solid phase micro-extraction, SPME)、同時蒸餾提取(simultaneous distillation extraction, SDE)、動態(tài)頂空樣品制備(dynamic headspace sampling, DHS)和吹掃捕集(Purge & Trap, P&T)，再結(jié)合氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-olfactrometry-mass spectrometry, GC-O-MS)進(jìn)行香氣成分的分析[3-10]。

在揮發(fā)性成分檢測方面，GC-MS可以發(fā)揮極大作用，在橄欖油中被檢測出的揮發(fā)性化合物的數(shù)量已經(jīng)超過180多種[11]，但研究表明在大量的揮發(fā)性化合物中其實(shí)只有很小的一部分對食品風(fēng)味有貢獻(xiàn)[12]。另一方面，有些香氣物質(zhì)濃度較低，不能通過 GC-MS 檢測到，但同時因?yàn)槠溟撝狄草^低，實(shí)則其對樣品的香氣貢獻(xiàn)程度很大，所以單純依靠 GC-MS 檢測存在很大局限性。GC-O 是將氣相色譜的分離能力與人類鼻子敏感的嗅覺相結(jié)合鑒定食品香氣物質(zhì)的一種方式，可以彌補(bǔ)GC-MS的不足之處。同時可以采用電子鼻結(jié)合PCA對幾種橄欖油進(jìn)行相似度對比分析，結(jié)果更準(zhǔn)確。

本文采用SPME-GC-O-MS結(jié)合電子鼻對在中國銷售較好的6種進(jìn)口特級初榨橄欖油進(jìn)行分析鑒定，以期對中國進(jìn)口橄欖油風(fēng)味檢測提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

西班牙：品利特級初榨橄欖油、貝蒂斯特級初榨橄欖油

意大利：歐麗薇蘭特級初榨橄欖油、歐薩特級初榨橄欖油

希臘：愛琴尼雅特級初榨橄欖油、希波克特級初榨橄欖油

1.2 試劑

NaOH(分析純)，西隴科學(xué)股份有限公司；乙醚、異丙醇、百里香酚酞、95%乙醇、異辛烷(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；系列正構(gòu)烷烴(C7～ C30)(色譜純)，北京化學(xué)試劑公司；4-甲基-2-戊醇(色譜純)，美國Sigma公司；正己烷(色譜純)，美國Fisher公司。

1.3 儀器與設(shè)備

iNose型電子鼻,上海瑞玢國際貿(mào)易有限公司；BSA224S-CW型電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；UV-2800A型紫外可見分光光度計,龍尼柯(上海)儀器有限公司；40 mL頂空瓶,德國Gerstel公司；固相微萃取手動進(jìn)樣器50/30 μm DVB/CAR/PDMS,美國Supelco公司；HH-1 數(shù)顯電子恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司；7890A-7000B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有EI離子源及NIST 08數(shù)據(jù)庫,美國Agilent公司；6890N-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司；Sniffer9000 型嗅聞儀,瑞士Brechbuhler公司；30 m×0.25 mm×0.25 μm DB-Wax和DB-5色譜柱,美國J&W公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 感官評價

橄欖油感官評價有8個經(jīng)專業(yè)訓(xùn)練的嗅聞人員完成，品評需在明亮、安靜且無味的環(huán)境下進(jìn)行。品評前1 h品評人員不得進(jìn)食氣味較大的食物，不得沾染異味，以免影響品評結(jié)果。品評期間需獨(dú)立完成。每個樣品間需間隔2 min再繼續(xù)進(jìn)行評定。量取樣品各10 mL置于40 mL頂空瓶中，觀察其澄清度，嗅聞并評分。評分標(biāo)準(zhǔn)采用10分制，能強(qiáng)烈感受到指定風(fēng)味記為10分，無法感受到記為0分；極澄清記為10分，極渾濁記為0分。

1.4.2 品質(zhì)指標(biāo)測定

酸價和紫外吸光值分別依照GB5009.229—2016和GB/T22500—2008/ISO 3656:2002進(jìn)行測定[13-14]。

1.4.3 固相微萃取(SPME)操作方法

用5 mL移液槍移取10 mL橄欖油樣品于40 mL頂空瓶中，再用10 μL微量注射器吸取1 μL濃度為401 μg/μL的內(nèi)標(biāo)物4-甲基-2-戊醇[15-16]于頂空瓶中，蓋蓋密封。將頂空瓶置于60 ℃水浴鍋中平衡20 min，然后將SPME萃取頭插入頂空瓶中，推出纖維涂層使其開始吸附香氣成分，吸附時間為40 min，最后將纖維涂層收回，拔出萃取頭準(zhǔn)備進(jìn)樣。

1.4.4 GC-O-MS分析條件

氣相色譜條件：色譜柱：DB-Wax石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)、DB-5石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250 ℃，解析5 min；升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持3 min；然后以5 ℃/min升溫至200 ℃；最后以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持3 min；以高純氦氣(He)為載體，恒定流速1.2 mL/min；進(jìn)樣方式為不分流。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(electron impact，EI)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z40～500。進(jìn)樣口溫度250 ℃，傳輸線的溫度為280 ℃。

嗅聞條件：為了防止實(shí)驗(yàn)員鼻黏膜干燥，需將加濕空氣以30 mL / min的速度供應(yīng)到嗅聞口。

1.4.5 化合物定性方法

化合物的鑒定由3種方法結(jié)合使用：NIST庫檢索；計算化合物的保留指數(shù)(RI)，并與flavornet中標(biāo)準(zhǔn)RI值進(jìn)行對比；通過嗅聞口嗅聞到的氣味特征，與檢索出化合物的標(biāo)準(zhǔn)風(fēng)味進(jìn)行對比定性。

其中保留指數(shù)(RI)的計算方式是根據(jù)C7～ C30的系列正構(gòu)烷烴換算得到，公式如下：

(1)

式中：n表示正構(gòu)烷烴的碳原子個數(shù)，tn表示正構(gòu)烷烴Cn的保留時間，tn+1表示正構(gòu)烷烴Cn+1的保留時間，ta表示樣品中某未知化合物的保留時間(需滿足ta處于tn與tn+1之間)。

1.4.6 化合物定量方法

以濃度為401 μg/μL的4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標(biāo)物(樣品中本身不存在內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，且內(nèi)標(biāo)與其他物質(zhì)出峰互不影響)，通過峰面積與濃度的關(guān)系計算得到未知化合物的濃度，公式如下：

(2)

式中：CIS為內(nèi)標(biāo)物的濃度，AIS為內(nèi)標(biāo)物的峰面積，Cx為未知化合物的濃度，Ax為未知化合物的峰面積。

1.4.7 電子鼻檢測

每種油樣量取10 mL，備用。先用空氣清洗傳感器，清洗時間為200 s，然后通過真空泵將樣品中的氣體吸入到電子鼻中，進(jìn)氣速度為1 L/min，檢測時間為240 s。每種油樣品做3個平行，每個平行樣品測定1次。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種橄欖油感官評價結(jié)果分析

如圖1所示，特級初榨橄欖油風(fēng)味輪廓中，果香、青草香、甜香和油脂香為主要貢獻(xiàn)風(fēng)味，而蘑菇、醋酸和金屬的香氣成分貢獻(xiàn)就相對較小。除甜香和醋酸差異較大外，其他幾種風(fēng)味趨勢均相似，只是強(qiáng)度上略有不同，其整體風(fēng)味也會有差異。經(jīng)分析比較感官鑒評結(jié)果可得西班牙的品利、貝蒂斯在果香、青草香和金屬香方面特別契合，其他風(fēng)味上略有差別，但總體趨勢一致，都極澄清，喜好排名分別為5和6；意大利的歐麗薇蘭和歐薩在果香、金屬和蘑菇香強(qiáng)度上最為一致，油脂香和青草香略有差別，整體風(fēng)味較統(tǒng)一，澄清度均不高，喜好排名分別為2和4；希臘的愛琴尼雅、希波克果香、青草香和金屬香強(qiáng)度最為相似，甜香和蘑菇香略有差別，整體風(fēng)味較相似，均較澄清，喜好排名分別為3和1。通過感官鑒評，可以從感官的角度區(qū)分各類橄欖油并了解人們對各種橄欖油的喜好程度。

圖1 6種橄欖油間氣味輪廓比較分析圖Fig.1 Comparative analysis of odor profile in six kinds of olive oil

2.2 6種橄欖油酸價和紫外吸光度比較

本實(shí)驗(yàn)所用特級初榨橄欖油樣品的酸價和紫外吸光度如表1所示。從各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)值可得所有樣品均符合特級初榨橄欖油的等級要求(酸度≤0.8%，即1.6 mg/g，K232≤2.50，K270≤0.22)[17]。

2.3 氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜(GC-O-MS)聯(lián)用對不同橄欖油香氣成分分析

表1 橄欖油的主要品質(zhì)指標(biāo)Table 1 The major quality indicators of olive oil

本次試驗(yàn)選取了3個國家6種特級初榨橄欖油為研究對象，經(jīng)SPME-GC-O-MS通過DB-Wax和DB-5兩根色譜柱進(jìn)行分析，得到總離子流圖，如圖2和圖3所示。

圖2 特級初榨橄欖油(歐薩)DB-Wax總離子流圖Fig.2 Total ionic chromatogram of extra virgin olive oil (ousa, DB-Wax)

圖3 特級初榨橄欖油(歐薩)DB-5總離子流圖Fig.3 Total ionic chromatogram of extra virgin olive oil (ousa, DB-5)

經(jīng)分析檢測得到了65種揮發(fā)性香氣活性化合物，如表2所示。表2結(jié)果顯示，檢測到的揮發(fā)性香氣活性化合物中，醛類物質(zhì)最多，達(dá)到16種，其次還有醇類12種，酯類9種，酮類6種，烯烴及萜烯類8種，芳香類5種，酸類3種和6種其他類型化合物協(xié)同生成橄欖油風(fēng)味。其中，醇類物質(zhì)可以貢獻(xiàn)橄欖果香或其他清新的香氣成分，且其含量較高，如順-3-己烯-1-醇(青草味)，但因其閾值也較大[9,18]，所以貢獻(xiàn)相對較弱；醛類物質(zhì)可以呈現(xiàn)青草味、果味、苦味和澀味等豐富且積極的風(fēng)味，如己醛(青草味)、反式-2-己烯醛(苦杏仁)、反式-2-壬烯醛(黃瓜，脂肪)等，因其閾值較低，所以對橄欖油風(fēng)味貢獻(xiàn)極大；酯類提供果味，如乙酸順式-3-己烯酯(青香蕉)；酮類提供辛辣味，如6-甲基-5-庚烯-2-酮(胡椒，蘑菇)，閾值低，貢獻(xiàn)也較大；芳香類和帖烯類相對閾值較大，貢獻(xiàn)較低[18]。結(jié)合化合物含量與嗅聞結(jié)果可得，特級初榨橄欖油中特征香氣成分有反-2-己烯醛(苦杏仁)、己醛(青草味)、反-2-壬烯醛(黃瓜，脂肪)、6-甲基-5-庚烯-2-酮(胡椒，蘑菇)和順-3-己烯-1-醇(青草味)等小分子化合物。如圖4所示，各品牌橄欖油香氣成分種類差別不大，但在整體化合物含量上存在差異。貢獻(xiàn)最大的醛類以愛琴尼雅含量最高，貝蒂斯最低，差距極大；醇類以歐薩含量最高，但其他幾類橄欖油中相對含量也不低，差距不大；酮類物質(zhì)希波克含量極高，其他幾種油樣中含量均較低，差距不大；酸類物質(zhì)希波克中含量極高，其次為品利和愛琴尼雅，貝蒂斯、歐麗薇蘭和歐薩中幾乎不存在；酯類物質(zhì)以愛琴尼雅含量居首位，其他呈梯度遞減；芳香類物質(zhì)以希波克含量極高，其他呈遞減狀態(tài)。由于其各類風(fēng)味物質(zhì)的含量不同綜合作用，因此各品牌橄欖油風(fēng)味也有不同程度的區(qū)別。

表2 6種特級初榨橄欖油主要揮發(fā)性香氣成分Table 2 The major volatile aroma components in six kinds of extra virgin olive oil

注：表中“-”表示不存在，“RI”表示通過對比保留指數(shù)確定的物質(zhì)，“MS”表示通過質(zhì)譜確定的物質(zhì)，“O”表示可以嗅聞鑒定到其香氣特征。

2.4 電子鼻對不同種類橄欖油香氣成分分析

電子鼻檢測到的橄欖油樣品氣味信號經(jīng)過PCA分析如圖5所示，其中主成分1和主成分2的累積方差貢獻(xiàn)率為99.8%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于85%，說明此次所選定測定的風(fēng)味成分的貢獻(xiàn)極大，基本可以代表樣品的的整理信息；DI值代表區(qū)分度，DI值越大，表示區(qū)分效果越好，此次分析DI值為94.6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于85%，區(qū)分度極高，說明電子鼻能很好地應(yīng)用于這6個橄欖油油樣品的區(qū)分。

圖4 不同品牌橄欖油間化合物含量比較分析圖Fig.4 Comparative analysis of volatile compound content in six kinds of olive oil

圖5 6種橄欖油氣味特征主成分分析(PCA)圖Fig.4 Principal component analysis of odor characteristic in six kinds of olive oil

結(jié)合圖4、圖5可以看出，對橄欖油風(fēng)味貢獻(xiàn)最大的醛類及醇類的含量在歐薩、愛琴尼雅及希波克中較為接近，與圖5中3種樣品相似度更高相符合，同時因?yàn)樵谕悺⑺犷惡头枷泐愔邢２说暮慷济黠@高于其他幾種油樣，所以希波克單獨(dú)處于第四象限內(nèi)。由圖4可知，貝蒂斯各類香氣物質(zhì)含量與其他幾種油樣相比普遍較低，所以與其他油樣也有較大的區(qū)分度，由圖5可得貝蒂斯獨(dú)自處于第一象限。品利和歐麗薇蘭由于各種類型香氣物質(zhì)含量居中，與其他幾種樣品也都具有一定的相似度，所以在圖5中也處于幾類樣品之間。綜上所述，SPME-GC-O-MS與電子鼻所測結(jié)果基本相符。

3 結(jié)論

采用SPME-GC-O-MS分離鑒定了來自西班牙、意大利和希臘的6種特級初榨橄欖油的揮發(fā)性香氣成分。在6個不同品牌的特級初榨橄欖油中共鑒定出了65種風(fēng)味化合物，其中可嗅聞到的有21種，主要是小分子醛和醇，還有一些相應(yīng)的酮、酸、酯及帖烯類也有發(fā)揮作用。特級初榨橄欖油中特征香氣成分有反-2-己烯醛、己醛、反-2-壬烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮和順-3-己烯-1-醇等，由定量結(jié)果可得各香氣物質(zhì)含量的差異導(dǎo)致不同品牌橄欖油風(fēng)味的差異。感官評價表明果香、青草味、油脂味和甜味為橄欖油的主要風(fēng)味，與SPME-GC-O-MS檢測所得結(jié)果基本吻合。電子鼻結(jié)合PCA分析檢測中通過對其累計方差貢獻(xiàn)率及區(qū)分度的計算分析得出電子鼻能很好的應(yīng)用于這6種橄欖油的區(qū)分鑒定，結(jié)合SPME-GC-O-MS所得各類香氣化合物含量與電子鼻相似度對比分析可得二者所測結(jié)果基本相符。綜上所述，感官評價、氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜(GC-O-MS)聯(lián)用及電子鼻結(jié)合PCA分析可以較好的對特級初榨橄欖油中的揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行比較研究。