茶酒穩(wěn)定性及抗氧化特性分析

王杰，楊海濱，張瑩，鄔秀宏，李中林，徐澤

(重慶市農業(yè)科學院 茶葉研究所，重慶，402160)

茶酒是以茶葉為主要原料，經(jīng)直接浸提或生物發(fā)酵、過濾、陳釀、勾兌而成的飲料酒，既保留了傳統(tǒng)白酒的風格，又皆具茶香[1-2]。茶酒中富含茶多酚、茶多糖、咖啡堿、游離氨基酸、維生素及礦物質元素等多種營養(yǎng)功能成分，具有良好的營養(yǎng)保健效果[1-9]。

我國茶酒產品包括配制型、發(fā)酵型、汽酒型等，但由于缺乏相關生產技術規(guī)范、產品標準以及生產技術設備，存在市場容量小、品種花色少、品質不穩(wěn)定等問題。當前對于茶酒的研究主要集中在工藝優(yōu)化、香氣分析和品類開發(fā)等方面[10-15]。

本研究以自制的烘青綠茶、工夫紅茶為原料分別加工配制成綠茶酒和紅茶酒，分析其貯藏過程中茶多酚、色澤、沉淀量以及抗氧化特性的變化，以期為茶酒的生產利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

2016年7月在重慶市農業(yè)科學院茶葉研究所科技示范園采摘福鼎大白茶鮮葉，并以此為原料制作烘青綠茶和工夫紅茶；42%、52%、62%(vol)高粱酒均由重慶永松白酒制造有限公司提供。

1.1.2 主要試劑

Na2CO3、沒食子酸、KH2PO4、K2HPO4、甲醇(色譜純)，重慶永捷實驗儀器有限公司；福林酚試劑，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；1,1-二苯-2-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)、偶氮二異丁基脒鹽酸鹽(2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH)、水溶性維生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-teramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)、熒光素二鈉，上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外-可見分光光度計，日本島津公司；722可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；FA1004 電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；5810臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；ALPHA1-4LSC真空冷凍干燥機，德國Christ公司；酶標儀，美國BIO-RAD公司；UltraScan PRO測色儀，美國HunterLab公司。

1.3 方法

1.3.1 茶酒制備

(1)粉碎茶樣：浸提前，先將茶葉粉碎，以提高浸提率，粉碎方法參照GB/T 8303—2013。

(2)浸提：將粉碎茶樣分別用62%(vol)的高粱酒浸提，得到質量濃度分別為5、10、15 g/L的母液，并置于4 ℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)降度調配：將母液分別用42%、52%(vol)的高粱酒混合，并添加一定量的調味劑，混勻后于室溫放置，得到質量濃度分別為0.5、1.0、1.5 g/L的茶酒產品。樣品編號見表1。

表1 茶酒樣品編號Table 1 Sample number of tea wine

1.3.2 感官審評

參考并修改邱新平等人的方法[16]，從外觀、香氣、口感和風格4個方面進行感官審評，評價標準見表2，由此確定適合生產配制型茶酒的茶酒質量濃度及高粱酒酒精度，并開展穩(wěn)定性和抗氧化特性評價。

表2 茶酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of tea wine

1.3.3 穩(wěn)定性評價

將1.3.2中感官評價得分最高的茶酒于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、15、30 d，通過測定茶多酚含量、色澤和沉淀量的變化來評價茶酒的穩(wěn)定性。

1.3.3.1 茶多酚

采用福林酚法，參照GB/T 8313—2008。

1.3.3.2 色澤

室溫條件下，用UltraScan PRO測色儀測定每個樣品的色差L*、a*、b*值。其中L*值代表亮度；a*值代表紅綠色度(正值表示紅色程度，負值表示綠色程度)；b*值代表黃藍色度(正值表示黃色程度，負值表示藍色程度)。

1.3.3.3 沉淀量[17]

取已搖勻的一定質量的茶酒，加入到已稱重的50 mL離心管中。4 ℃下，10 000 r/min離心20 min，棄掉上清液，將沉淀真空冷凍干燥至恒重，稱量離心管和凍干沉淀的總質量。沉淀量(mg/kg)按式(1)計算：

(1)

式中：m1,離心管和凍干沉淀的總質量，g；m0，離心管的質量，g；M，茶酒質量，g。

1.3.4 抗氧化能力評價

選取1.3.2中感官評價得分最高的茶酒，通過ORAC法和DPPH法來評價茶酒成品酒的抗氧化能力，以高粱酒作對照。

1.3.4.1 ORAC法

參考并改進GRAJEDA-IGLESIAS等[18]人的方法。該反應在pH 7.2的磷酸鹽緩沖液體系中(75 mmol/L)進行。在96孔黑色熒光酶標板各微孔中加入空白液、Trolox標準液及待測樣品溶液50 μL，37 ℃黑暗孵育10 min，然后向各微孔中添加熒光素二鈉溶液(0.126 μmol/L)150 μL，中速振搖2 min，37 ℃黑暗孵育10 min，然后加入AAPH溶液(153 mmol/L)25 μL，迅速啟動反應，以激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm連續(xù)測定熒光強度。每次測定前振蕩5 s，連續(xù)測定40次，時間間隔為4 min，直至熒光衰減至基線。ORAC值用式(2)、(3)計算，以μmol Trolox/g茶酒樣品表示。

AUC=(0.5×f1/f1+f2/f1+f3/f1…+fn/f1+…+f39/f1+0.5×f40/f1)×ΔT

(2)

ORAC值/〔(μmol Trolox)·g-1〕=〔(AUCs-AUCb)/(AUCt-AUCb)〕/(Ct/Cs)

(3)

式(2)、(3)中：AUC表示熒光熄滅曲線下面積；f1為第1次熒光讀數(shù)；fn為第n次熒光讀數(shù)；ΔT為間隔測定時間4 min；AUCs為樣品液熒光衰減曲線下面積；AUCt為Trolox標準液熒光衰減曲線下面積；AUCb為空白試劑熒光衰減曲線下面積；Ct為Trolox標準液的摩爾濃度；Cs為樣品液的摩爾濃度。

1.3.4.2 DPPH法

參考并適當修改CARMONAJIMéNEZ等[19]人的方法。將茶酒稀釋成40 mg/mL的樣品液，在12 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清液待測。稱取0.1 g DPPH溶于200 mL無水乙醇中，取10 mL稀釋至100 mL，得到0.05 mg/mL的DPPH自由基溶液。

樣品準備：Ⅰ：2 mL待測液+2 mL DPPH自由基溶液；Ⅱ：2 mL待測液+2 mL無水乙醇；Ⅲ：2 mL無水乙醇+2 mL DPPH自由基溶液，搖勻后避光反應40 min，在517 nm條件下測定吸光度。按照式(4)計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率/%=(1-(AⅠ-AⅡ)/AⅢ)×100

(4)

式中：AⅠ,樣品液加入DPPH后的吸光度;AⅡ,樣品液自身的吸光度;AⅢ,空白加入DPPH后的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0進行差異顯著性檢驗和Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 茶酒的感官評價

不同茶湯濃度及高粱酒酒精度對茶酒品質影響的結果見表3。

表3 茶酒感官評價得分Table 3 Scores of sensory evaluation for tea wine

2.2 茶酒的穩(wěn)定性評價

以42%(vol)、52%(vol)酒精度的高粱酒調配的綠茶酒中，質量濃度為1.0 g/L時的感官審評得分最高，且G52的總分高于G42。可以發(fā)現(xiàn)，隨著茶湯質量濃度的增加，茶酒的綠色程度也隨之加深，當高粱酒的酒精度為42%(vol)時，出現(xiàn)了少量絮狀物沉淀。研究表明[20]，當白酒酒精度超過50%(vol)時具有較好的溶解性，但降度后，棕櫚酸、油酸、亞油酸及其乙酯類會由于溶解性降低而析出白色沉淀，并且茶多酚等易溶于乙醇的化合物也會因溶解性降低而導致茶酒出現(xiàn)渾濁沉淀。此外，隨著茶湯質量濃度的增加，茶酒的香氣評分逐漸增高，但口感評分則先增加后降低，這可能與茶酒中的茶多酚、咖啡堿等一類具有苦澀味物質的含量及其相互作用有關。

以42%(vol)高粱酒配制的紅茶酒中，質量濃度為1.0 g/L時的感官審評得分最高；52%(vol)高粱酒配制的紅茶酒中，質量濃度為1.5 g/L時的感官審評得分最高，且B53的總分高于B42。同樣地，隨著茶湯濃度的增加，茶酒的紅色程度逐漸加深，尤以B53最為紅艷，這可能也與酒精度的高低和茶紅素等色素類物質在酒中的溶解性有關。此外，當茶湯質量濃度較高時，紅茶酒的香氣、口感評分也都較高，但茶湯濃度較低時，茶酒的茶味相對淡，典型性不夠。因此，選定G52和B53開展茶酒的穩(wěn)定性和抗氧化特性評價。

2.2.1 茶多酚含量的變化

綠茶酒和紅茶酒中的茶多酚含量及其在茶酒貯藏過程中的變化趨勢，見圖1。

圖1 茶多酚含量在茶酒貯藏過程中的變化Fig.1 Change in tea polyphenols contents of tea wine during storage注：同一樣品中不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著，圖2、圖3同

由圖1可知，G52的茶多酚含量高于B53，由于紅茶屬于全發(fā)酵茶，加工過程中茶多酚在多種氧化酶的作用下生成茶黃素、茶紅素等物質，因而茶多酚的含量低于綠茶[21]。此外，G52和B53的茶多酚含量在貯藏過程中均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，且G52的降低幅度高于B53，0～15 d的降低幅度高于15～30 d。由于茶酒中富含茶多酚、咖啡堿、蛋白質等多種生化成分，在一定條件下，這些生化成分在貯藏過程中會發(fā)生絡合反應形成團聚物，導致茶酒中的茶多酚含量逐漸降低；綠茶酒中的茶多酚在光照、有氧的條件下會發(fā)生氧化聚合反應，形成茶色素類物質，因而綠茶酒中茶多酚含量的降低幅度高于紅茶酒[22]；此外，貯藏0～15 d時，茶酒體系中的氧氣相對充足，發(fā)生各種氧化聚合反應的速率相對較快，當超過15 d后，氧氣較為缺乏，各種生化反應的速率相對較慢，整個茶酒體系處于相對平衡穩(wěn)定的狀態(tài)，因而茶多酚含量在貯藏0～15 d時的降低幅度高于15～30 d。

2.2.2 茶酒色澤的變化

茶酒的色澤可通過L*、a*、b*值的大小來表征，G52和B53的色差L*、a*、b*值大小及其在貯藏過程中的變化趨勢，見圖2。

圖2 色差L*、a*、b*值在茶酒貯藏過程中的變化Fig.2 Change in color parameters L*, a* and b* values of tea wine during storage

由圖2可知，L*值在貯藏過程中逐漸降低，且G52的L*值高于B53，即茶酒的亮度隨貯藏時間的增加而逐漸降低，且綠茶酒的亮度高于紅茶酒；a*值在貯藏過程中逐漸增加，即綠茶酒的綠色程度逐漸降低、紅茶酒的紅色程度逐漸增高；G52的b*值在貯藏過程中逐漸增加，B53的b*值基本無變化，且B53的b*值始終高于G53，即綠茶酒的黃色程度隨貯藏時間的增加而逐漸增高，紅茶酒的黃色程度較為穩(wěn)定，且紅茶酒的黃色程度始終高于綠茶酒。可以發(fā)現(xiàn)，茶酒在貯藏過程中會發(fā)生褐變現(xiàn)象，而茶酒褐變的原因主要是酶促褐變，即茶多酚在多酚氧化酶等多種酶的作用下被氧化成茶黃素、茶紅素和茶褐素等物質，導致茶酒色澤褐變；其次，美拉德反應、焦糖化反應、抗壞血酸的氧化分解等一系列非酶促褐變反應也會使茶酒色澤加深、變暗；此外，對綠茶酒而言，在酸性條件下，葉綠素中的Mg2+會被H+取代而形成褐色的脫鎂葉綠素，從而加深綠茶酒的褐變程度[23]。

2.2.3 茶酒沉淀量的變化

綠茶酒和紅茶酒中的沉淀量及其在茶酒貯藏過程中的變化趨勢，見表4。

表4 沉淀量在茶酒貯藏過程中的變化Table 4 Change in precipitation capacity of tea wine during storage

注：同一列不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著。

由表4可知，隨著貯藏時間增加，G52和B53的沉淀量也呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢。貯藏30 d后，G52和B53的沉淀量分別由(0.377±0.056)、(0.368±0.066) mg/kg增加至(0.512±0.052)、(0.507±0.039) mg/kg，增加幅度分別為35.81%、37.78%，可以發(fā)現(xiàn)，綠茶酒和紅茶酒的沉淀量大小及其在貯藏過程中的變化趨勢較為接近。由于茶酒中含有茶多酚、茶黃素、咖啡堿、蛋白質、金屬離子等生化成分，當溫度較低時，這些化合物通過氫鍵、疏水作用、離子鍵等作用力結合成團聚物[17,22]，進而導致茶酒的沉淀量增加。茶酒中沉淀的產生容易使茶酒品質下降，為解決該問題，可采取向茶酒中添加包埋劑(β-環(huán)糊精等)、抗氧化劑(抗壞血酸等)、澄清劑(殼聚糖、硅藻土、明膠等)、酶(單寧酶、果膠酶、纖維素酶等)等多種方式來澄清茶酒，進而提升茶酒品質。

2.3 茶酒的抗氧化特性評價

茶酒的ORAC值和DPPH自由基清除率大小及其在貯藏過程中的變化趨勢，見圖3。

一般來說，茶酒的ORAC值和DPPH自由基清除率越高，表示其抗氧化特性越好。由圖3可知，隨著貯藏時間的增加，G52、B53的ORAC值及DPPH自由基清除率逐漸減小，貯藏30 d后，G52的ORAC值及DPPH自由基清除率分別由(859.63±65.71) μmol Trolox/g和(84.26±1.94)%降低至(684.21±39.54) μmol Trolox/g和(75.19±0.84)%，B53的ORAC值及DPPH自由基清除率分別由(728.48±59.48) μmol Trolox/g和(82.45±2.26)%降低至(600.45±36.79) μmol Trolox/g和(72.48±0.88)%，且0～15 d時的降低幅度相對較大，15～30 d時抗氧化特性的變化不顯著，說明茶酒的抗氧化效果在貯藏初期會隨著時間的增加而顯著減弱，而貯藏后期時的抗氧化效果較為穩(wěn)定，這可能與茶多酚等生化成分含量的減少，以及貯藏后期時的整個體系處于相對平衡的狀態(tài)有關。此外，G52、B53的ORAC值及DPPH自由基清除率顯著高于普通高粱酒，這主要是由于茶酒富含多種具有抗氧化效果的生化成分。可見，適當?shù)仫嬘貌杈凭哂休^好的保健功效，且保健功效優(yōu)于普通高粱酒。

圖3 ORAC值和DPPH自由基清除率在茶酒貯藏過程中的變化Fig.3 Change in ORAC values and DPPH free radical scavenging capacity of tea wine during storage

3 討論

綠茶酒和紅茶酒均采用62%(vol)高粱酒浸提和52%vol高粱酒調配，質量濃度分別為1.0、1.5 g/L時的感官評分最高。貯藏30 d后，綠茶酒的茶多酚含量、亮度、綠色度、ORAC值和DPPH自由基清除率逐漸降低，黃色度及沉淀量逐漸增加；紅茶酒的茶多酚含量、亮度、ORAC值和DPPH自由基清除率逐漸降低，黃色度保持穩(wěn)定，紅色度及沉淀量逐漸增加，表明茶酒在貯藏過程中因發(fā)生各種氧化、聚合反應，茶多酚含量、澄清度和抗氧化能力均有所降低，其色澤則會逐漸褐變。

通過對穩(wěn)定性及抗氧化特性進行探究，對于茶酒的生產利用具有一定借鑒意義。可針對茶酒貯藏過程中出現(xiàn)的生化成分含量和澄清度降低、色澤褐變、抗氧化功效減弱等問題，進行品質改進的相關研究，如添加合適的包埋劑、抗氧化劑、澄清劑，篩選合適的茶樹品種，加工工藝的進一步優(yōu)化等。此外，茶酒的品質包括外觀、口感、香氣、風格，其中香氣是茶酒品質的重要組成部分，而目前對于茶酒香氣的研究主要采用定性分析，后期可結合精確定量分析和統(tǒng)計學方法對茶酒的特征性香氣組分進行探究。