常溫固態發酵魚粉的工藝優化

張飛，張海玲，王春利，王志高，羅紅宇*

1(浙江海洋大學 食品與醫藥學院，浙江 舟山，316022) 2(舟山富晟食品科技有限公司，浙江 舟山，316000)

隨著水產養殖業和捕撈業的飛速發展，飼料蛋白的需求量也越來越大。優質魚粉可以促進魚、蝦等對高營養物質的吸收利用，進而促進魚、蝦等的生長和繁殖，在當今的水產飼料中占據優勢地位。近年來，全球魚粉年產量維持在500～600萬t，目前，我國國內魚粉產量大約在50萬t，年均進口魚粉為130～150萬t[1]。

魚粉是以魚、蝦、蟹等或水產加工廢棄物為原料，經蒸煮、壓榨、脫脂(或不脫脂)、干燥、粉碎而獲得的粉狀或顆粒狀產品[2]。根據不同的加工原料，魚粉可大致分為白魚粉和紅魚粉：以鰭魚、狹鰭、黑線鰭等白肉魚類為原料生產的魚粉為白魚粉；以金槍魚、鮐魚、沙丁魚等紅肉魚類為原料生產的魚粉為紅魚粉[3-6]。魚粉的主要生產方式是干法和濕法。干法魚粉的生產工藝為原料破碎、干燥、脫脂、粉碎、篩粉、成品包裝[7-8]，其缺點為長時間高溫干燥使魚粉焦化呈褐色，破壞魚粉的營養成分，營養價值降低；濕法魚粉的生產基本實現了蒸煮、壓榨、干燥及油/水分離等過程的自動化流水線控制，減少了油脂氧化帶來的影響，提高了魚粉的質量，但在生產過程中容易造成游離氨基酸、水溶性蛋白質等營養成分的流失，降低了魚粉的營養價值。因此離心法、萃取法、水解法、發酵法等新的魚粉生產工藝正在逐漸取代傳統的干法和濕法，其中發酵法因原料適用性廣、消除抗營養因子、提高蛋白消化率及生物利用率、產品富含多種生物活性因子、工藝環保等優點開發潛力巨大。

水產養殖業和捕撈業的發展帶動了水產加工業的飛速發展，在加工過程中產生了大量如魚頭、魚皮、魚骨、魚鰾、蝦殼、蟹殼等下腳料，這些下腳料約占原料魚總重的40%～55%[9]，大部分作為飼料原料被粗放加工，不僅浪費資源，還污染環境。用這些下腳料作為魚粉生產原料，具有很好的應用前景。但發酵法需針對不同原料選用不同的菌種，發酵工藝參數也需相應調整。故本文利用研究室自行篩選出的復合菌株，發酵水產下腳料來生產魚粉，以總氮含量為評價指標，對影響發酵效果的關鍵工藝參數進行優化，旨在為發酵魚粉的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 發酵菌種

酵母菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌(1∶1∶1)混合菌粉，由本研究室經篩選、馴化、強化、量產制備。

1.1.2 試驗原料

小雜魚(梅魚、沙丁魚、鯷魚等)，購自浙江舟山市多加水產加工企業。

輔料：淀粉、糖蜜、植物蛋白粉，購自舟山本地。

1.1.3 實驗試劑

濃H2SO4、K2SO4、CuSO4、NaOH、HCl、H3BO3、甲基紅、溴甲酚綠、Na2CO3、茚三酮、KH2PO4、Na2HPO4，均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.4 實驗儀器與設備

YXQ-LS-75S 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HZQ-F160 全溫振蕩培養箱，上海今友試驗設備有限公司；JJ500 電子分析天平，廣州滬瑞明儀器有限公司；KDN-04消化爐，上海佐田精密有限公司；Kjeltec 8400 全自動凱氏定氮儀，上海瑞玢國際貿易有限公司；722G可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 影響發酵效果的單因素實驗

1.2.1.1 輔料添加量對發酵效果的影響

稱取絞碎的水產下腳料50 g于250 mL錐形瓶中，封口后于121 ℃滅菌20 min，冷卻后分別加入質量分數為0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10%的輔料[m(淀粉)∶m(糖蜜)∶m(植物蛋白粉)=1∶1∶1]，接入經活化的混合菌5%，攪拌混勻，置于30 ℃全溫振蕩培養箱中發酵96 h后測發酵液總氮含量。發酵過程中每隔4 h攪拌1次保證溶氧充分。

1.2.1.2 接菌量對發酵效果的影響

稱取經絞碎的水產下腳料50 g于250 mL錐形瓶中，封口后于121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入質量分數為1%的輔料[m(淀粉)∶m(糖蜜)∶m(植物蛋白粉)=1∶1∶1]，接菌量分別為1%、2.5%、5%、7.5%、10%，攪拌混勻，置于30 ℃全溫振蕩培養箱中發酵96 h后測發酵液總氮含量。發酵過程中每隔4 h攪拌1次保證溶氧充分。

1.2.1.3 發酵溫度對發酵效果的影響

稱取經絞碎的水產下腳料50 g于250 mL錐形瓶中，封口后于121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入質量分數為1%的輔料[m(淀粉)∶m(糖蜜)∶m(植物蛋白粉)=1∶1∶1]，接菌量5%，攪拌混勻，分別置于20、25、30、35、40 ℃發酵96 h后測發酵液總氮含量。發酵過程中每隔4 h攪拌1次保證溶氧充分。

1.2.1.4 發酵時間對發酵效果的影響

稱取經絞碎的水產下腳料50 g于250 mL錐形瓶中，封口后于121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入質量分數為1%輔料[m(淀粉)∶m(糖蜜)∶m(植物蛋白粉)=1∶1∶1]，接菌量5%，攪拌混勻，置于30 ℃全溫振蕩培養箱中，分別發酵24、48、72、96、120、144 h，發酵過程中每隔4 h攪拌1次保證溶氧充分，發酵結束后測發酵液總氮含量。

1.2.1.5 有氧和無氧發酵效果的比較

分別稱取經絞碎的水產下腳料50 g于4個250 mL錐形瓶中，封口后于121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入質量分數為1%的輔料[m(淀粉)∶m(糖蜜)∶m(植物蛋白粉)=1∶1∶1]，接菌量為5%，攪拌混勻，置于30 ℃全溫振蕩培養箱中發酵96 h后測發酵液總氮含量。發酵過程中，其中一個樣品每隔4 h攪拌1次;一個樣品前48 h每隔4 h攪拌1次；后48 h密封發酵，一個樣品前48 h密封發酵，后48 h每隔4 h攪拌1次；一個樣品96 h都密封發酵。

1.2.2 發酵工藝優化的正交試驗

在單因素試驗結果基礎上，結合實際生產情況，以徐修志[10]發酵優化實驗設計方法為基礎，采用有氧發酵，選取接菌量、發酵溫度和發酵時間3個因素進行正交優化，每個因素取3個水平，試驗設計如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factor level table of orthogonal test

1.2.3 發酵產物中總氮含量的測定

在楊亞麗[11]的方法基礎上改進：稱取發酵產物1.0 g左右(精準至0.000 1 g)于消化管中，加入0.3 g CuSO4，0.9 g K2SO4，12 ml濃H2SO4，經240 ℃碳化，400 ℃消化，消化液澄清(淡藍色或淺綠色)為消化終點，冷卻后得到待測樣品，采用全自動凱氏定氮儀測總氮含量。

1.2.4 游離氨基酸總量的測定

1.2.4.1 氨基酸標準曲線的制作[12]

準確吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的0.2 mg/mL的谷氨酸標準溶液，分別置于25 mL的具塞比色管中，然后加入體積分數為2%茚三酮溶液和磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.7)各1 mL，混合均勻，水浴加熱15 min取出，迅速冷卻至室溫，加水至標線，搖勻，靜置15 min后，在570 nm波長下，以試劑空白為參比測定各溶液吸光值(A)。以氨基酸質量(mg)為橫坐標，吸光值(A)為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4.2 原料和發酵液中游離氨基酸總量的測定

準確稱取樣品1.0 g，加水稀釋100倍，混勻備用。吸取樣品溶液1.0 mL，按照標準曲線制作步驟，在相同條件下測定吸光值(A)，用測得A值在標準曲線上即可查得對應的氨基酸質量(mg)。

1.2.4.3 結果計算

式中：C為從標準曲線上查得的氨基酸質量(mg)；m為測定的樣品溶液相當于樣品的質量(g)。

1.2.5 魚粉主要成分的測定

發酵產物經真空冷凍干燥制得魚粉，測定主要指標：粗蛋白， GB/T 6432—1994，凱氏定氮法；粗脂肪，GB/T 6432—1994，索氏抽提法；灰分，GB/T 6432—1994，高溫灼燒法；水分， GB/T 6432—1994，恒重法。

2 結果與分析

2.1 發酵工藝優化

2.1.1 輔料添加量對發酵產物總氮含量的影響

當輔料的添加量不同時，水產下腳料的發酵產物中總氮含量的結果見圖1。

圖1 輔料添加量對發酵產物中總氮含量的影響Fig.1 Effect of addition amount of excipients on total nitrogen content in fermentation products

如圖1所示，魚粉中輔料質量分數在0.5%～1.0%區間，發酵產物中總氮含量逐漸增加直至添加質量分數為1%的輔料時，總氮含量達到最大值，之后，總氮含量隨輔料添加量的增加呈下降趨勢。原因可能是輔料的添加在一定程度上彌補了發酵底物中碳氮源的不足，促進經了微生物的生長，但隨著輔料量的增加，碳源、氮源的含量增大，導致發酵體系的滲透壓增加，從而影響微生物的生長和代謝，甚至導致微生物死亡。因此，取質量分數為1%的輔料為較佳發酵工藝參數。

2.1.2 接菌量對發酵產物中總氮含量的影響

接菌量會對最終的發酵效果產生影響。林俊宏等[13]的研究表明，接菌量過少會導致發酵過程緩慢，發酵底物不能充分酵解，發酵效果不佳；接菌量過高時菌體過度生長，因菌株之間的營養競爭，影響菌株的生長代謝，造成原料中有機質的降解率下降。在不同接菌量條件下，發酵產物的總氮含量見圖2。

圖2 接菌量對發酵產物中總氮含量的影響Fig.2 Effect of inoculum size on total nitrogen content in fermentation products

由圖2可知，發酵產物的總氮含量隨著接菌量的增加呈先升后降的趨勢，當接菌量為5%時，總氮含量達到最高值3 338.86 mgN/100 g。原因可能是隨著接菌量的增加，菌體生長迅速，降解原料中有機質的速率增加，產生蛋白酶的量也增多，所以總氮含量逐漸升高；但當接菌量持續增加時，菌體的生長消耗了過量的底物營養，以致造成營養不足、生長受限、降解有機質的效率下降，總氮含量下降。

2.1.3 溫度對發酵產物中總氮含量的影響

溫度對微生物的生長代謝有著重要影響，溫度較低時，微生物體內的酶活力低，不利于原料中有機質的降解；溫度過高時，會使酶失活，加速菌體的衰老，影響發酵效果。在不同溫度條件下，發酵產物的總氮含量見圖3。

圖3 溫度對發酵產物中總氮含量的影響Fig.3 Effect of temperature on total nitrogen content in fermentation products

如圖3所示，發酵產物的總氮含量隨著溫度的升高呈先升后降的趨勢，與35～40 ℃發酵溫度相比，當溫度為25～35 ℃時，發酵產物的總氮含量較高。原因是微生物體內的酶促反應都有一定的溫度范圍，本試驗所用的3種混合菌中，枯草芽孢桿菌的適宜生長溫度為28～36 ℃[14]、植物乳桿菌的適宜生長溫度為28～37 ℃[15]、酵母菌的適宜生長溫度為20～30 ℃[16]。當混合發酵時，3種菌都適宜的生長溫度為30 ℃左右。

2.1.4 發酵時間對發酵產物中總氮含量的影響

發酵時間的研究長短會對發酵效果產生影響。談佳玉等[17]表明，發酵時間太短，微生物的生長繁殖就會受到影響，從而對有害微生物的抑制作用不強，蛋白酶的分泌不足，影響大分子蛋白的降解；發酵時間過長，發酵底物中營養物質就會被微生物的大量繁殖所消耗，而且雜菌大量生長，微生物的代謝產物也會發生變化，有可能導致發酵失敗。同時發酵時間過長不僅會提高輸出成本，還會影響產品生產周期，使產品品質不穩定。發酵時長不同時，發酵產物的總氮含量見圖4。

圖4 發酵時間對發酵產物中總氮含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on total nitrogen content in fermentation products

由圖4可知，發酵產物中總氮含量隨著發酵時間的延長不斷增加，當發酵時間為96 h時，發酵產物中總氮含量最高為3 409.33 mgN/100 g，之后總氮含量趨于平緩下降。原因可能是在發酵初期，由于發酵時間較短，菌體生長不完全，無法充分分解利用發酵底物，所以總氮含量較低，當底物降解完全后，繼續發酵，因營養不足，會抑制微生物增殖，進而菌體會出現自然溶解現象[18]。

2.1.5 含氧水平對發酵產物總氮含量的影響

含氧量是影響微生物機體生長和代謝繁殖的重要因素之一。含氧量不足會影響好氧微生物的生長，導致原料中有機質的降解受抑制，影響發酵效果。因為枯草芽孢桿菌、酵母菌為好氧菌，植物乳桿菌為厭氧或兼性厭氧菌，因此按1.2.1.5設計了4組發酵期間不同含氧量的試驗，發酵產物的總氮含量見圖5。

由圖5可知，全程有氧的發酵產物中總氮含量最高，全程缺氧的發酵產物中總氮含量最低，其他兩種情況的發酵產物的總氮含量居于兩者之間。其原因可能是枯草芽孢桿菌、酵母菌為好氧菌，盡管無氧條件下也能對發酵底物進行降解，但降解作用有限，而植物乳桿菌為厭氧或兼性厭氧菌，在無氧條件下會發酵產生乳酸，使發酵底物pH值改變，影響微生物生長。因此，正交實驗優化工藝時采用全程有氧發酵方式。

A-有氧；B-前48 h有氧后48 h無氧；C-前48 h無氧后48 h有氧；D-無氧。圖5 含氧量對發酵效果的影響Fig.5 Effect of oxygen content on Fermentation

2.1.6 微生物發酵魚粉正交試驗結果分析

發酵工藝優化的正交試驗結果如表2、表3所示。極差分析顯示，對發酵產物總氮含量影響強弱順序為C>B>A，即發酵時間影響最大，其次為發酵溫度，接菌量的影響最小。方差分析結果表明，發酵時間、發酵溫度的p<0.01，對總氮含量的影響十分顯著，接菌量的p<0.10，對總氮含量的影響顯著。確定優化的工藝條件為A3B2C2，即發酵時間為96 h，發酵溫度為30 ℃，接菌量為6%。在優化工藝條件下進行驗證試驗，平行測定3個樣品，測得發酵產物中總氮含量為3 462.67±50.45 mgN/100 g，說明此工藝是穩定、可行的。

表2 微生物發酵魚粉正交試驗結果分析表Table 2 Results of orthogonal test of microbial fermented fish meal

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

2.2 發酵液總游離氨基酸含量分析

2.2.1 氨基酸標準曲線

以氨基酸質量(mg)為橫坐標，吸光值(A)為縱坐標，得到氨基酸標準曲線如圖6所示。

圖6 谷氨酸標準曲線Fig.6 Standard curve of glutamic acid

經統計分析，得線性回歸曲線為：y=1.750 7x-0.064 6，R2=0.990 2，說明曲線可信度較高，可以運用。

2.2.2 原料和發酵液的游離氨基酸總量

已有研究表明混菌發酵后產物中氨基酸含量均高于未接菌的[19]。由表4可知，水產下腳料經微生物發酵后，游離氨基酸總量有明顯提高，由發酵前1.71 g/100 g提高到發酵后3.86 g/100 g，提高了1.26 倍。說明菌種分解原料蛋白質的能力較強，作為水產飼料的蛋白源，可以提高飼料的消化利用率。

表4 原料和發酵液的原料游離氨基酸總量Table 4 Total free amino acids in raw materials and fermentation broth

2.3 魚粉主要成分分析

水產下腳料經過微生物發酵，所得發酵產物經真空冷凍干燥后，濃縮得到發酵魚粉，其主要成分含量如表5所示。

蛋白質含量是評價魚粉質量的一項關鍵指標，也是影響魚粉價格的重要因素。蛋白質含量越高，魚粉質量越好，此外，魚粉中的粗脂肪、灰分和水分等也是評價魚粉的重要指標[20-24]，以不飽和脂肪酸為主的魚粉容易氧化從而造成魚粉品質下降，灰分越高就說明魚粉中魚骨砂石等就越多，魚粉品質就越差。由表5可知，魚粉中蛋白質質量分數為61.59 %，達到一級品標準；粗脂肪質量分數為12.43 %，達到二級品標準；灰分質量分數為17.52 %，達到一級品標準；水分質量分數為7.75 %，達到一級品標準。

表5 發酵魚粉主要成分含量Table 5 Contents of main components in fermented fish meal

3 結論

本文以水產下腳料為原料，利用微生物固態發酵法制備魚粉，通過對影響發酵效果的因素：輔料、接菌量、發酵溫度、發酵時間和含氧量，進行一系列的單因素試驗和正交試驗，最終確定最佳發酵工藝條件為：魚粉中輔料質量分數1%、接菌量6%、發酵溫度30 ℃、發酵時間96 h、有氧發酵。在此發酵條件下，發酵產物中總氮含量達到(3 462.67±50.45) mgN/100 g。發酵液經濃縮后所得魚粉營養指標接近一級品，其中關鍵質量指標蛋白質含量達到國標一級品標準。本研究充分挖掘了水產下腳料的資源價值，工藝技術綠色、安全，為優質魚粉的開發提供了一定的技術支持，具有良好的應用前景。

魚粉是水產飼料中蛋白質的主要來源，微生物發酵制備魚粉可以在人工控制的條件下，通過一些有益微生物在飼料原料中進行一系列的新陳代謝和生長繁殖，將飼料原料中那些對動物有毒有害的物質或動物不能完全消化吸收的物質進行轉化分解，從而產生容易被動物消化吸收的無毒無害的代謝產物和富含消化酶及益菌體的飼料。而且，利用微生物發酵生產魚粉可以使大分子的動物蛋白分解成小分子的肽和氨基酸，使魚粉具有更高的附加值，具有更廣闊的市場前景。