超聲輔助高速均質制備人乳脂類似物乳液工藝優化

楊溶，覃小麗，楊貴妃，鐘金鋒，劉雄

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

傳統嬰幼兒配方乳液中的油脂配料(植物油和牛乳脂)雖與人乳脂在脂肪酸組成上接近，但在甘油酯結構上仍存在較大差異，這種差異易造成脂肪酸(能量)和鈣的雙重損失[1-2]。近十年來，利用酶法催化動植物油獲得富含1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油酯(1,3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol，OPO)的人乳脂類似物(或人乳脂替代品)是嬰幼兒配方乳液研究的熱點之一[3-5]。相比傳統嬰幼兒配方乳液中油脂配料，人乳脂類似物富含OPO，使脂肪酸易于吸收，能減少不溶性鈣皂并改善腸道健康[6-8]。目前，以人乳脂類似物作為新一代嬰幼兒配方乳液的油基，制備的人乳脂類似物乳液有較好的前景；然而，該方面的研究還較少[9]。

嬰幼兒配方乳液通常采用高壓均質技術獲得，如DRAPALA等[10]以大豆油為油基采用兩步高壓均質法制備嬰幼兒配方乳液，重點研究了水解乳清蛋白和麥芽糖糊精的結合物對乳液熱穩定性的影響；ZOU等[11]以酶法制備的結構脂為芯材采用高壓均質法(34.47～48.26 MPa)制備嬰幼兒配方乳液，研究了抗氧化劑對該乳液氧化穩定性的影響。超聲輔助高速均質乳化法具有操作簡單，形成乳液粒徑小、分布窄，高穩定性等特點[12-16]。然而，關于利用超聲輔助高速均質乳化法制備嬰幼兒配方乳液的研究尚未見報道，乳液的形成規律尚未明確。

本研究以更為經濟的分提方式制得富含OPO的豬油，同其他油料調配獲得人乳脂類似物，并以此為分散相，通過對人乳脂類似物乳液的制備工藝進行優化，重點考察了蛋白質、人乳脂類似物和磷脂的添加量以及超聲時間、功率對乳液形成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白(CAS# 9006-59-1，純度為81.47%)、酪蛋白(CAS# 9000-71-9)和大豆卵磷脂(CAS# 8002-43-5),合肥博關生物科技有限公司；37種脂肪酸甲酯混合標準品(CRM 47885)，Sigma-Aldrich(中國)公司；大豆油，重慶紅蜻蜓油脂有限責任公司；豬油，重慶市北碚區天生路永輝超市；油茶籽油，江西春源綠色食品有限公司；椰子油，上海冉浩實業有限公司；豬胰脂肪酶(CAS# 9001-62-1)，合肥博美生物技術有限責任公司；乙醚、正己烷、石油醚、甲醇、KOH、膽酸鈉、HCl等試劑均為分析純，重慶市鈦新化工公司；超純水,由東莞亞仕蘭YSL-RO-15L/H型實驗室超純水機制得。

1.2 儀器與設備

BZY-3B型自動表/界面張力儀，上海衡平儀器儀表廠；Zetasizer Nano ZS90型激光粒徑儀，英國Malvern公司；T18 ULTRA-TURRAX型高速均質機、RW20 DIGITAL型電動攪拌機、Topolino型磁力攪拌器，德國IKA公司；JY98-IIIDN型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；MX-S可調式漩渦振蕩器，大龍興創實驗儀器(北京)有限公司；GC-2010型氣相色譜儀，日本島津科技有限公司；PB-10 標準型pH計，德國賽多利斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 人乳脂類似物的調配

根據人乳脂的脂肪酸結構、組成以及人乳脂類似物調配數學模型[17]，以33L-豬油(經干法分提得到33 ℃呈液體部分)為基礎油料，與油茶籽油、大豆油和椰子油進行調配得到人乳脂類似物，采用氣相色譜測定其脂肪酸組成與分布。將其充入氮氣保存于-20 ℃，用于制備人乳脂類似物乳液。

1.3.2 乳液的制備

采用超聲輔助高速均質法制備人乳脂類似物乳液。首先，制備水相，分別稱取一定質量的磷脂、乳清蛋白、酪蛋白于燒杯中，加超純水于30 ℃下磁力攪拌2 h，添加疊氮化鈉溶液(最終濃度為0.02%)抑菌，調節水相的pH值為6.8，置于4 ℃靜置12 h使其中的蛋白質充分溶脹。然后，將一定質量的人乳脂類似物添加于水相，攪拌(500 r/min，5 min)后高速均質(20 000 r/min，2 min)，獲得粗乳液。最后，采用超聲處理粗乳液(工作時間為5 s，間歇3 s)，用冰水浴使溫度不超過30 ℃，得到的人乳脂類似物乳液用于后續粒徑、分布系數(polydispersity index，PDI)、zeta電位、表面張力和外觀觀察等性能表征。

表1 均勻設計因素水平Table 1 Factors and levels of uniform design

根據GB 10767—2010 《較大嬰幼兒配方食品》 中規定[18]：即食狀態下較大嬰幼兒配方食品每100 mL所含能量應不低于250 kJ，且每100 kJ能量中蛋白質為0.7～1.2 g，脂肪為0.7～1.4 g。與前期預實驗結果相結合，確定考察因素及范圍：超聲時間(2～32 min)，超聲功率(60～660 W)，蛋白質(1.75%～3.1%，基于乳液的總質量計算的質量分數)、人乳脂類似物(1.75%～3.55%，基于乳液的總質量計算的質量分數)和磷脂(0.05%～0.5%，基于乳液的總質量計算的質量分數)，用DPS 7(data processing system 7)數據系統處理U12(122×53) 混合水平均勻設計方案，因素水平見表1。探究不同因素對人乳脂肪類似物乳液的粒徑、zeta電位、PDI和表面張力的影響。

1.3.3 檢測方法

1.3.3.1 人乳脂類似物的總脂肪酸組成測定

采用KOH-甲醇酯化法對人乳脂類似物進行甲酯化，具體操作參考胡燁敏等[19]的方法并加以改進。準確吸取10 μL油料于15 mL離心管中，加入2 mL正己烷，振蕩樣品充分溶解；加入2 mL 0.5 mol/L的KOH-甲醇溶液，于45 ℃條件下充分振蕩5 min，靜置5 min，加入6 mL飽和NaCl溶液，搖勻10 s后離心(5 000 r/min，5 min)，吸取上層正己烷(含脂肪酸甲酯)，待氣相色譜檢測。氣相色譜的檢測條件：色譜柱：DB-23毛細管柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：N2；流量：1.0 mL/min；分流比為50∶1；進樣量：1 μL；進樣口溫度為250 ℃；FID 檢測器溫度為280 ℃；初始柱溫度為60 ℃，以7 ℃/min升至220 ℃，保持35 min。以37種脂肪酸甲酯混合標準品為參考，并采用面積歸一法計算脂肪酸的相對含量。

1.3.3.2 人乳脂類似物的sn-2位脂肪酸組成測定

參照覃小麗等[20]的方法，以酶法水解油樣并采用硅膠薄層層析法對水解產物進行分離，獲得sn-2位單甘酯進行甲酯化和氣相分析，方法條件和步驟見1.3.3.1。

1.3.3.3 乳液的粒徑、PDI及zeta電位的測量

采用Zetasizer Nano ZS 90激光粒徑儀測定人乳脂類似物乳液的粒徑、PDI和zeta電位情況。為了盡量降低多重光散射效應，將乳液用超純水稀釋1 000倍。水相溶液的折射率設置為1.33，測試溫度為25 ℃，平衡時間為2 min。樣品平行測定兩組，每組測定3次，每次測量值為13個子測試運行結果的平均值。

1.3.3.4 表面張力的測定

采用表面張力測量儀在(23±1)℃下測定乳液的表面張力。取一定體積乳液加入樣品池中，調節粗調旋鈕、微調旋鈕使鉑金片與乳液接觸，并讀取數值。每個樣品至少重復測定3次，確保證測量差值在1 mN/m以內。

1.3.3.5 乳液的外觀

將鮮乳液裝入10 mL螺口玻璃瓶，在25 ℃下靜止放置，定期觀察人乳脂類似物乳液體系的變化，包括是否有油滴析出、絮凝沉淀、乳液分層等現象。觀察若干天，文字記錄現象并拍照。

1.3.4 數據處理與統計

實驗結果以平均值±標準差表示。本研究對多組間平均值的比較采用SPSS 18.0軟件進行one-way ANOVA 及Duncan分析，p<0.05為顯著性差異，并采用DPS 7數據統計軟件對均勻設計相關數據進行二次回歸統計分析。

2 結果與分析

2.1 人乳脂類似物的脂肪酸組成與分布

人乳脂的脂肪酸組成及其分布是制備人乳脂類似物的黃金原則[21]，選擇4種油料(油茶籽油、大豆油、椰子油、33L-豬油)進行調配得到人乳脂類似物。由表2可看出，油茶籽油富含不飽和脂肪酸(如C18∶1n-9和C18∶2n-6總脂肪酸含量分別為79.63%和7.70%)作為人乳脂類似物中不飽和脂肪酸的主要來源。椰子油富含中碳鏈脂肪酸，其中C10∶0和C12∶0總脂肪酸含量分別為6.04%和53.37%，為人乳脂類似物提供中碳鏈脂肪酸。大豆油含有較豐富的必需脂肪酸(如C18∶3n-3總脂肪酸含量為5.15%，C18∶2n-6總脂肪酸含量可達53.56%)，有助于調節人乳脂類似物中C18∶2n-6/C18∶3n-3值，人乳脂中C18∶2n-6/C18∶3n-3的比值在5～15時有助于嬰兒的智力發育和視力[22]。

表2 各種油脂的總脂肪酸組成 單位：%

注：C10∶0為癸酸；C12∶0為月桂酸；C14∶0為肉豆蔻酸；C16∶0為棕櫚酸；C18∶0為硬脂酸；C18∶1n-9為油酸；C18∶2n-6為亞油酸；C18∶3n-3為亞麻酸；—表示未檢出。表3同。

表3 各種油脂的sn-2位脂肪酸組成 單位：%

豬油由于其特殊的脂肪酸組成和甘油酯結構是制備人乳脂類似物的最佳原料之一。由表2和表3可知，33L-豬油中C16∶0總脂肪酸和sn-2位脂肪酸含量分別為25.76%和69.25%，由此可知sn-2位棕櫚酸相對含量可達89.61%；C18∶1n-9總脂肪酸和sn-2位脂肪酸含量分別為36.42%和10.52%，由此可計算其在sn-1,3位的相對含量90.37%。這提示該33L-豬油富含OPO，能夠從甘油三酯結構層面上為制備與人乳脂高度相似的人乳脂類似物提供保障。

結合上述，根據4種油的脂肪酸組成及分布的特點，以及人乳脂的脂肪酸組成及分布的準則[1]，采用軟件SPSS 18計算上述4種原料油脂，按比例(19.78%油茶籽油、15.15%大豆油、10.28%椰子油和50.80% 33L-豬油)進行調配得到人乳脂類似物。由表2可知，人乳脂類似物中總脂肪酸含量均在人乳脂的參考范圍內，其中C18∶2n-6/C18∶3n-3的比值為12.82。此外，結合表2、表3可計算出人乳脂類似物中sn-2位棕櫚酸相對含量可達67.03%，與人乳脂中sn-2位棕櫚酸相對含量(>70%)接近，這表明調配制備的人乳脂類似物在脂肪酸結構上與人乳脂具有較好的相似性。人乳脂類似物在其制備工藝(經干法分提獲得的33-L豬油為基礎調配獲得)上，與酶法合成的OPO相比，具有簡單易操作等優勢。

2.2 人乳脂類似物乳液的影響因素

以5個因素(蛋白質、人乳脂類似物和磷脂的添加量及超聲時間和功率)為自變量，采用均勻設計對超聲輔助高速均質法制備人乳脂類似物乳液形成的影響因素進行探討，結果見表4。并通過DPS 7軟件對實驗數據進行二次多項式逐步回歸處理，建立指標模型概況見表5。

表4 混合均勻設計表及實驗結果Table 4 Design of mixed uniform and experimental results

表5 指標模型概況Table 5 Summary of the model parameters

由均勻設計結果可知，乳液的PDI(0.17～0.23)和Zeta電位(-37.0～-40.2 mV)變化范圍較小，且有研究表明PDI<0.2 和Zeta電位小于-30 mV，乳液粒徑分布比較均一，單體聚合的穩定性良好[23-24]，故不選擇以PDI和Zeta電位為指標進行乳液制備條件的優化。此外，鑒于乳液粒徑在均勻設計組中變化幅度(約63 nm)較大，所以選取粒徑的模型進行最佳條件的確定。對粒徑回歸模型進行預測分析，得到預測的優化條件：超聲功率為108 W，超聲時間為32 min，蛋白質添加量為2.76%，人乳脂類似物添加量為1.75%，磷脂添加量為0.5%。

2.3 最佳工藝的驗證試驗

按照優化條件進行驗證試驗(n=3)，得到的人乳脂類似物乳液粒徑為(169.5±1.30 )nm(n=3)，與預測值(173.8 nm)相吻合。對該乳液進行19 d儲藏試驗發現，粒徑在7 d內變化幅度不大(第7天的粒徑為184.7 nm)，而之后的儲藏中，粒徑上升趨勢較陡峭并在19 d后到達283.9 nm，說明乳液在7 d內穩定性較好；此外，乳液在儲藏過程中，其PDI和zeta電位變化均較小，且都在可接受范圍內(圖1)。

圖1 儲藏時間對人乳脂類似物乳液粒徑、PDI和Zeta電位的影響Fig.1 Effect of storage time on average particle size, PDI and Zeta potential of human milk fat analogue emulsion注：圖1中不同小寫字母表示組間平均值有顯著差異(p<0.05)。

由圖2可得，比較第1天和第19天的粒徑分布，表明第19天相對第1天的粒徑分布圖向右偏移，可能是由于乳液的液滴之間相互聚集導致粒徑偏大，與圖1中粒徑變化趨勢一致。

此外，儲藏19 d后乳液外觀未出現明顯分層，只是液面上出現一層非常薄的乳白色絮狀物，這可能由于乳液中部分粒徑較大的液滴發生聚集而形成。總之，通過超聲輔助高速均質法可獲得物理穩定的人乳脂類似物乳液，為后續研究嬰兒配方乳液的功能調控提供技術支持。

圖2 第1天和第19天人乳脂類似物乳液粒徑分布和外觀圖Fig.2 Particle size distribution and appearance of human milk fat analogue emulsion at 1 and 19 day

3 總結

本研究以33-L豬油(富含OPO)為主要油料調配成人乳脂類似物，脂肪酸組成與人乳脂類相近，并且其sn-2位棕櫚酸相對含量可達67.03%，C18∶1n-9在sn-1,3位的相對含量78.28%，這說明人乳脂類似物在脂肪酸的結構上能更好地模擬人乳脂。以上述人乳脂類似物為油脂芯材，采用均勻設計優化超聲輔助高速均質法制備人乳脂類似物乳液，建立了影響乳液粒徑的條件優化模型，獲得的乳液最小粒徑可達169.5 nm。對該模型進行分析可知，影響乳液粒徑的主要因素為超聲時間和蛋白質的添加量；在一定范圍內，延長超聲時間和增加蛋白質含量有利于減小乳液的粒徑。通過采用均勻設計優化人乳脂類似物乳液的制備工藝可得到物理穩定性好的乳液，以期為新一代嬰兒配方乳液的制備提供提供重要理論依據和技術支持。