精子細胞XRCC1基因rs25487位點多態性與少弱精患者的相關性研究*

姚佳欣陳詩言劉青松蘇敏張大鵬

(1.川北醫學院檢驗系，四川 南充 637000; 2. 川北醫學院附屬醫院檢驗科， 四川 南充 637000；3. 什邡市人民醫院檢驗科， 四川 德陽 618400)

據統計，全球已婚夫婦不孕不育的比例高達10%～15%，其中男性原因引起的不育約占50%[1-2]。少精弱精癥是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。少精弱精癥的病因不明，可能與精索靜脈曲張、睪丸發育受阻、染色體畸變及相關基因突變等有關。研究表明，在人類精子形成過程中，基因表達轉錄水平的改變(基因突變或易感性)會影響相關基因蛋白的表達，導致精子發生障礙[3-4]。其中精子DNA損傷將影響精子受精能力、受精卵分裂以及胚胎發育[5]。當精子DNA損傷后，與DNA損傷修復相關基因多態性也可能會影響其功能，導致不同個體修復能力有所差異，最終影響男性生育力[6]。

X射線交叉互補修復基因1(X-rayrepaircrosscomplementing1,XRCC1)是一種重要的DNA堿基切除修復基因[7]，通過編碼蛋白質與DNA連接酶Ⅲ相互作用，修復DNA單鏈斷裂[5]。該基因rs25487位點G→A與無精癥發病風險存在爭議。有研究表明，外周血XRCC1基因rs25487位點G→A與陜西回族[8]和漢族[4]人群的無精癥發病風險存在關聯，認為AA基因型可增加無精癥發生的風險；也有研究認為AA基因型可以減少特發性無精子癥的易感風險[7]。故本研究采用精子細胞DNA為研究對象，證明XRCC1基因rs25487位點G→A多態性與少弱精的相關性。

1　材料與方法

1.1研究對象少弱精患者來自川北醫學院附屬醫院2015年9月～2016年8月門診病例，所有病例經精液常規檢查，按世界衛生組織(WHO)標準進行，均符合少弱精子癥的診斷標準。納入標準：少精：精液量<2.0ml；弱精：MI (a+b級精子百分率)<50%。健康對照人群為隨機選自在同一醫院男性健康體檢者，且精液常規檢測未發現異常，無既往相關病史。共入選182例少弱精患者和73例健康正常男性 。少弱精患者的平均年齡為(30.62±6.15)歲，健康對照者的平均年齡為(29.18±5.01)歲。

1.2樣本收集精液標本采集前，要求禁欲5～7 d，手淫法取精液于干燥消毒的量杯中，置于37℃恒溫水浴箱內液化，1h內利用。精液分析完成后，經4000 r/min離心10min，棄上清，留取沉淀物進行DNA提取。

1.3精子基因組DNA提取采集精液沉淀物，利用血液基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進行精子細胞DNA提取。參照試劑說明書和通過兩次裂解及延長消化時間至30min的改進，提取精子細胞基因組DNA，-80℃保存備用。

1.4XRCC1基因rs25487位點基因多態性檢測采用聚合酶鏈反應-限制性段長度多態性(PCR-RFLP)方法檢測。XRCC1基因rs25487位點的上游引物：5′-TCA CAC CTA ACT GGC ATC TTC ACT-3′，下游引物：5′-CTC CTT CCC TCA TCT GGA GTA CC-3′，20μl擴增反應體系中包含2×PCR Taq Green Master Mix 10μl，7μl Nuclease-Free Water和上、下游引物各0.5 μl(C=1. 0 mol/L)，DNA模板2 μl。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，59℃退火30s，72℃延伸45s，35個循環后，72℃延伸10min。產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(100V電壓，0.5×TBE電泳緩沖液)20min，凝膠成像后分析結果。取8.5μl的PCR產物，加入1μl Buffer Tango和0.5μl限制性內切酶MSPⅠ (Fermentas，Lithuania)，總體積10μl，37℃水浴孵育24h。酶切后，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳(100V，0.5×TBE電泳緩沖液)50min，凝膠成像后分析結果。

1.5 統計學分析利用SPSS 13.0軟件進行統計分析，精液常規分析結果采用隨機t檢驗；XRCC1基因rs25487位點SNP多態性采用Chi-square檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1XRCC1基因rs25487位點遺傳多態性檢測結果經過PCR擴增，瓊脂糖電泳擴增片段大小在330bp位置(圖1A)。限制性內切酶酶切后，野生型產物GG基因型產生177、153bp兩個片段，突變純合子產物AA基因型只有330bp片段，突變雜合子產物GA基因型產生330、177、153bp3個片段(圖1B)。

圖1　XRCC1基因rs25487位點PCR產物和酶切產物瓊脂糖電泳圖Figure 1　Electrophoresis diagram of the PCR products and enzyme-digested products of XRCC1 gene rs25487 site

注：A. PCR產物電泳圖，M：Marker Ⅲ，泳道1和2為正常組精子細胞DNA的PCR產物，泳道3和4為少弱精患者精子細胞DNA的PCR產物；B.酶切后產物電泳圖，M：50bp DNA Ladder Marker；泳道1和3為GG基因型，泳道2為AA基因型，泳道4為GA基因型

2.2XRCC1基因多態與精液質量的關聯分析精液常規檢測結果顯示，在相同的年齡階段，少弱精患者的精子濃度和精子活率顯著低于健康人群，精液的液化時間顯著增加，差異均存在統計學意義(P<0.05)，而精液量無顯著差異(P>0.05)，見表1。不同基因型與精液常規參數的關系結果顯示，XRCC1基因Rs25487位點多態性與精液量不存在關聯(P>0.05)，但與液化時間、精子活力和精子濃度存在顯著關聯。攜帶AA純合突變型個體與GG野生型相比，精子濃度和精子活力明顯降低，液化時間明顯延長，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

Table1Comparisonofclinicaldatabetweendifferentexperimentalgroups

　參數少弱精組(n=182)健康對照組(n=73)tP年齡(歲)30.62±6.1529.18±5.011.630.104精子濃度(×109/L)35.33±27.0678.98±40.399.7870.000精液量(ml)4.47±1.834.49±1.300.9150.361液化時間(min)47.33±21.0141.10±17.45-2.2190.004RP活率(×10-2)30.00±13.5763.78±9.8819.1360.000

表2　XRCC1基因Rs25487位點多態性與精液常規常見參數的關系Table 2　The correlations between the polymorphism of XRCC1 gene Rs25487 site and parameters of routine semen analysis

注：與野生型相比，①P<0.05

2.3XRCC1基因rs25487位點基因型和等位基因頻率的分布情況與健康對照組相比，少弱精患者攜帶突變型基因型的比例顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與GG基因型個體相比，攜帶AA基因型的個體患少弱精癥的風險是GG基因型的7.84倍(95%CI低值為1.019)，說明AA基因型是少弱精癥的易感因素。XRCC1基因rs25874位點兩種等位基因頻率G、A在少弱精組和健康對照組中分布差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3　少弱精患者XRCCI基因 rs25487位點基因型和等位基因頻率與健康對照組之間的相關性[n(×10-2)]Table 3　The correlation genotype and allele frequency of rs25487 with the normal group

3　討論

精液量、液化時間、精子濃度和精子活率是衡量精子質量常用指標，也是造成男性不育或生育力下降的主要原因。精漿是精子活動的介質和營養來源，可中和陰道的酸性分泌物，以免影響精子活力，故精液量減少可導致精子活力低下；液化時間延長或不液化可抑制精子活動，從而減少受孕機會，其主要原因是前列腺分泌液化因子減少，導致蛋白水解酶缺乏[9]。精子濃度和精子活力可以直接反應遺傳能力，如果二者下降可能同時伴有精子DNA損傷率上升，精漿活性氧升高，精子細胞凋亡率上升，精子形態的變化以及精子膜完整性下降[10]。本研究中，我們對少弱精患者和健康人群此兩種參數比較發現，精液量差異無統計學意義(P>0.05)，但少弱精患者的液化時間顯著增加，精子濃度和精子活力顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

男性生殖是一系列復雜的生理過程，大約有2000多個基因參與此過程的調控。近年研究發現，很多常染色基因參與和調節男性生殖過程[11]。XRCC1是第一個被分離出來的參與修復離子輻射所致損傷的哺乳類動物的修復基因[12]。XRCC1基因定位于人類染色體19q13.2～13.3區域，大小為33kb，包含17個外顯子和16個內含子[13]。研究表明，XRCC1基因位點rs25487與精子生成障礙可能相關。張健等通過對79例回族非梗阻性無精癥患者和82例對照組進行XRCC1基因rs25487位點基因分型和等位基因頻率分析發現，GA與GA+AA基因型是非梗阻性無精癥的危險因素，A等位基因突變在非梗阻性無精癥患者中的頻率明顯高于對照組(P<0.05)。提示XRCC1基因rs25478位點G→A可能與回族人群非梗阻性無精癥的發病風險存在關聯[8]。另有研究對該位點在特發性精子缺乏漢族人群中的研究發現同樣類似結果[4]。但也有研究認為，與GG基因型相比，AA基因型可以減少特發性無精子癥的易感風險[7]。

在本研究中，我們選擇漢族少弱精患者為研究對象，采用精子DNA對XRCC1基因rs25487位點GG、AA、GA3種基因型頻率進行分析，結果顯示，少弱精患者和對照組中XRCC1基因rs25487位點GG、AA、GA3種基因型頻率的分布存在顯著性差異(P=0.041)：與GG基因型相比，AA基因型患少弱精癥風險是GG基因型的危險因素(OR=7.84，95%CI：1.019～60.365)，與其他一些腫瘤易感性的研究結論相似[14-15]；而兩種等位基因頻率G、A分布差異無統計學意義(P>0.05)。這與之前報道不完全一致，其原因可能為研究對象不同和DNA來源不同。

外周血(體細胞)和生殖細胞(精子細胞)中DNA存在差異。外周血和精液都能夠檢測出DNA反應遺傳性狀[16]，但精子發生是一個非常復雜的過程，容易受到外部環境因素的影響而可能發生斷裂或突變[17]，常常能發現精子細胞與體細胞存在基因型的不同[18]。因此，精液能直觀地反映配子狀態，利用精液來提取DNA更有利于男性不育的病因研究和檢測[19]。同時研究表明，不育男性與正常男性精子在轉錄水平上存在重要區別[20]，且不育男性精子細胞內某些相關基因的多態性將是不育診治研究的突破點。因此，本研究采用精子細胞DNA作為研究少弱精XRCC1基因rs25487位點多態性的結果更能直接說明基因多態性與生精障礙的相關性。但是因精子遺傳物質處于高度濃縮狀態，一直以來被認為是一種轉錄沉默的細胞[19]，且精子DNA含非常豐富的魚精蛋白和組蛋白，且與魚精蛋白之間形成牢固的二硫鍵，導致精子DNA很難從核蛋白中分離[4]。研究表明，提取高質量精液基因組DNA成功的關鍵因素是精子裂解液[19]及消化時間。然而市場上精子裂解液價格昂貴，造成眾多研究者采用外周血DNA替代精子DNA作為研究精子的對象。本研究采用血液基因組DNA提取試劑盒，通過兩次裂解及延長消化時間，成功獲取精子DNA，獲得滿意的PCR產物和酶切效果。

4　結論

本研究結果顯示，少弱精患者的精子濃度和精子活力顯著降低，液化時間顯著延長，且XRCC1基因rs25487位點AA基因型是患少弱精癥遺傳的易感基因位點。