不同濃度復合維生素對海參幼苗生長性能、腸道酶活性及其免疫功能的影響

孫尚智，劉文斌，王文喜

（1．江蘇敖眾生物技術有限公司，江蘇　南京　223001；2．南京農業大學，江蘇　南京　210095）

全世界海參約有120種[1]均屬海洋種類。在我國海域分布的有10多種，其中以黃、渤海的刺參（Apostichopus japonicas Selenka）品質最佳。刺參是蛋白質含量高、糖類豐富而不含膽固醇的珍貴海產品，具有很高的食用和藥用價值，其經濟價值可稱之為“參”中之冠[2]。現代醫學證明，海參含有的酸性黏多糖對人體的成骨、生長、創傷愈合以及預防組織老化、動脈硬化等均有特殊功能[3]；五肽及三萜糖苷等成分具有抗腫瘤、抗炎活性和溶血作用[4－5]。20世紀90年代來我國沿海地區海參的人工養殖業蓬勃發展，但是由于養殖過程中的不規范運作等，使海參養殖中存在的病害問題也逐漸凸現起來，如皮膚潰瘍、腐皮、水腫，給養殖戶造成了慘重的經濟損失[6－7]。對于海參的病害，人們至今還沒有找到一個合適的解決方法，這種困境嚴重制約了該產業的持續健康發展[8]。維生素作為一種應用免疫增強劑，是水產動物維持正常生長和生命活動所必需的營養物質。目前，在水產養殖業界也普遍認為在飼料中添加適量的維生素是很有必要的[9]，因為大多數的維生素在水產動物體內是不能合成的，需要從飼料中額外攝取[10]。

復合維生素作為一種納米級水產用液體維生素，主要含有維生素、肌醇、牛磺酸、氨基酸以及免疫促生長因子、抗應激活性因子等。它不僅能夠滿足水產動物不同生長階段營養需求，預防維生素缺乏，還能夠增強免疫力，促進食欲。

該試驗就是將這種液體維生素添加到海參幼苗飼料中，通過生長性能、腸道酶活性等指標來最終確定海參幼苗對這種復合維生素的最適需求量。

1　材料與方法

1．1試驗材料

1．1．1海參刺參為 2 月齡幼苗，體長 0．5～1．0 cm，總初重2．5 kg，規格為10 000頭/kg左右，由山東省某有限公司提供。

1．1．2試驗飼料與復合維生素試驗用飼料選用魚粉、鼠尾藻粉、海帶粉、海泥、滸苔為主要原料。

1．2試驗設計和養殖條件

試驗在山東好當家育苗基地進行。自2014年7月10日開始，在好當家的一個生產車間，選擇28個標準育苗池，每個池子為 9 m×2 m×1．2 m，設6個試驗組和1個對照組，試驗組分別用濃度為0．03%、0．05%、0．07%、0．09%、0．11%、0．13%的復合維生素拌料。對照組為第一組，其余分別為二、三、四、五、六、七組。每組四個重復，每個育苗池放2．5 kg，規格為10 000頭/kg左右的海參苗，采用定時定量的投喂方式，每天15:30－16:00之間喂料。5～7 d倒一次池子，同時清理池底排泄物，為期2個月。

表1　復合維生素的主要組成成分保證值（每1000mL該品中含有）

1．2．1生長測定和樣品采集從試驗開始后的第30 d，從各水槽隨機抽取20個刺參樣品，置于－20℃冰箱內作為以后分析刺參生化組成的樣品，在試驗結束后再隨機抽取20個刺參樣品，測量體質量后并置于－20℃冰箱內作為生化組成分析的樣品。體質量的測量方法是把刺參從培養皿中輕輕取出后，在干濾紙上放置30 s后快速用1/104電子天平稱量。為了減少操作誤差，試驗過程中體質量的測量均由同一固定試驗人員完成。刺參的飼料系數（FCR）計算公式為：

飼料系數（FCR）=投入飼料量（g）/體質量增加量（g）。

1．2．2樣品生化組成的分析

1．2．2．1消化酶活性測定總蛋白酶采用福林－酚法[11]（單位定義：在27℃條件下，每分鐘水解酪素產生相當于1 μg酪氨酸所需的酶量，規定為一個酶活力單位）。淀粉酶（單位定義：每毫克蛋白在27℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個淀粉酶活力單位）采用南京某公司試劑盒測定。

1．2．2．2吸收酶活性測定Na+,K+－ATP 酶活性（單位定義：每小時每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產生1μmol無機磷的量）采用南京某公司試劑盒測定。

1．2．2．3抗氧化指標測定CAT、AOC、MDA、SOD均采用南京某公司試劑盒測定。

1．2．2．4免疫指標測定

溶菌酶活性采用南京某公司試劑盒測定。

1．3數據處理對海參幼苗的生長性能，腸道酶活性及其免疫力用平均數±標準差表示（n=4），經SPSS 19．0統計軟件分析。所有數據進行方差分析，并進行Duncan多重比較。P＜0．05表示差異具統計學意義，P＜0．01表示差異極具統計學意義。

2　結果

2．1添加不同濃度復合維生素對海參幼苗生長性能的影響

圖1　添加不同濃度復合維生素與海參幼苗增重率的關系

由圖1可以看出，在一定范圍內，隨著復合維生素添加量的增加，每組的增重率顯著增加（P＜0．05），在達到最高點后再下降，最高點出現在第五組，即添加量為0．09%時，海參幼苗生長情況最好，復合維生素添加量超過0．09%時，增重開始下降，且除最高水平組外，試驗組增重率均大于對照組，由此可見，復合維生素添加量在一定范圍內可提高海參幼苗的生長速度。復合維生素添加量在0．09%時對海參的生長最有利，但是在試驗中也發現第五組雖然長勢最好，但是海參苗大小不均，差距很大，小苗（2 000頭/kg以下）基本沒長，在更高水平組也是如此，大苗（2 000頭以上/kg）生長情況良好，小苗長勢差。第三組和第四組，參苗較均勻，小苗均能長起來，所以使用復合維生素拌料時應大小苗區分開，大苗添加量建議在 0．07%～0．09%，小苗應控制在 0．07%以下，最好在 0．05%左右。

由圖2可以看出，隨著復合維生素添加量的增加，餌料系數降低，最低點出現在第五組，當添加量超過0．09%時，餌料系數又隨之升高，且除第七組外其余各試驗組均低于對照組，通過對比可知，復合維生素的添加可以降低餌料系數。

表2　初重、末重、增重率和投喂量

圖2　添加不同濃度復合維生素與餌料系數的關系

2．2添加不同濃度復合維生素對海參幼苗腸道酶活的影響

2．2．1添加不同濃度復合維生素對海參幼苗腸道消化酶的影響

由圖3可以看出，在試驗開始30 d時的海參幼苗隨著復合維生素添加量的增加，淀粉酶的活性有一定程度的改變，但是并不顯著，且第一組淀粉酶活性高于其他組（P＞0．05）。在試驗60 d的海參幼苗隨復合維生素添加量的增加發生顯著性變化，但是第一組的酶活性顯著高于除第三組外的其他試驗組（P＜0．05）。隨著添加量濃度的增加，淀粉酶的活性在第五組時處于最低值。

圖3　添加不同濃度復合維生素對海參幼苗淀粉酶活性的影響

在圖4中，隨著復合維生素添加量的增加蛋白酶活性發生了改變。在試驗開始30 d時，第四組海參幼苗體內蛋白酶的活性最高但差異不具統計學意義（P＞0．05）。試驗開始 60 d時，第六組海參幼苗體內蛋白酶的活性最高且變化顯著（P＜0．05）。這種結果在一定程度上說明了蛋白酶受到復合維生素含量的影響。

2．2．2添加不同濃度強參液對海參幼苗腸道吸收酶的影響

由圖5可以看出，經過30 d和60 d飼養試驗，Na+,K+－ATPase酶活性都有相應的變化。在30 d時，對照組的酶活性顯著高于其他組且第三組最低。在60 d對照組刺參組織中Na+,K+－ATPase吸收酶的活性較30 d初始酶活性有下降，但在60 d時第六組吸收酶活性顯著高于除第四組外的其他各組（P＜0．05），且隨后有下降。這種趨勢表明強參液對Na+,K+－ATPase酶活性有一定影響。

圖4　添加不同濃度復合維生素對海參幼苗蛋白酶活性（U/mg protein）的影響

圖5　添加不同濃度復合維生素對海參幼苗Na+,K+－ATPase酶活性（U/g protein）的影響

2．3添加不同濃度復合維生素對海參幼苗抗氧化指標的影響

添加不同濃度復合維生素對海參幼苗抗氧化酶指標的影響見表3、表4。結果表明，經過30 d、60 d，的分組飼喂后，刺參幼苗的抗氧化酶因復合維生素添加量的不同而不同，且都有顯著性的變化。在養殖30 d后CAT的活性在第2組顯著高于其他組（P＜0．05），而第五組的酶活性達到最低值。但是經過60 d的飼養后CAT酶活的最高值出現在了第六組，且顯著高于除第四組外的其他各組（P＜0．05），最低組出現在了對照組。對于AOC酶的活性，在養殖30 d后第一組的酶活性顯著高于其他組（P＜0．05），而在60 d時第五組的酶活性又顯著高于其他組（P＜0．05）。在30 d時MDA含量在第六組最高且將近是最低組的兩倍，而在60 d時MDA含量在第六組達到最大值但差異不具統計學意義（P＞0．05）。對于SOD來講，它的最大值都發生在第四組，而酶活性最低的卻不是同一組。

表3　添加不同濃度復合維生素對30天海參幼苗抗氧化酶指標的影響

表4　添加不同濃度復合維生素對60天海參幼苗抗氧化酶指標的影響

2．4添加不同濃度復合維生素對海參幼苗免疫力的影響

不同濃度復合維生素對海參幼苗溶菌酶活性的影響如圖6。在30 d和60 d的飼喂試驗中，第四組溶菌酶活性均是最高但差異均不具統計學意義（P＞0．05）。

3　討論

3．1　復合維生素對刺參幼苗生長性能的影響

圖6　添加不同濃度復合維生素對海參幼苗溶菌酶活性（μg/mL）的影響

關于刺參的生物學特性和生理學特點，已有一些學者對其進行了研究和報道[12－13]，刺參主要生活在有機物豐富的潮間帶和海洋底部，以沉積物、底棲生物以及動植物性有機碎屑為食物來源。在海參腸道內可觀察到有各種無機微粒，微型海洋底棲生物，海洋動植物碎屑，貝殼碎片及其微生物。刺參不分晝夜都在積極進食，每小時大約可吞食6 g沉積物和泥沙。刺參對海洋底泥中的有機物的消化率大約為15%，對植物性餌料的消化率為67．5%～76．4%，對動物的碎屑、硅藻、細菌以及真菌的消化率最高，可達到87%[14－15]。在自然環境下，這些食物可以充分地滿足海參自身生長的需求，但是對于人工養殖的刺參來講，由于它們自身沒有合成一些維生素的能力或者是體內合成的維生素量不能充分滿足其生長、抗逆和抗病的需求，從而造成其成活率降低，并出現生長減緩等癥狀[16]，這就需要在人工喂養的海參飼料中添加一定量的維生素來滿足其生長需求。目前，有關單一維生素在水生動物上的應用已有較多的報道[17－19]。例如：Okorie 等[20]用精制的海參飼料研究了0～1 045 mg/kg的維生素C對刺參［體質量：（1．49±0．07）g］生長性能的影響，這次的研究結果顯示，在飼料中加入維生素C可以顯著提高它的特定生長率。周歧存等[21]對皺紋盤鮑的研究表明維生素E可以促進其生長。楊奇慧等[22]研究發現飼料中添加適量維生素A在凡納濱對蝦生長的早期有促生長作用。但是，有關飼料中添加混合性維生素對刺參幼苗生長的影響報道較少。在該研究中，往飼料中添加不同濃度的混合性維生素復合維生素對刺參幼苗的增重率和餌料系數產生了顯著性影響。與對照組相比，試驗組第四組的增重率顯著（P＜0．05）高于其他組，且餌料系數又處于最低水平，結果表明復合維生素的添加濃度在0．09%時刺參幼苗的生長和營養利用效率最好。該研究發現幼參增重率并未隨著復合維生素添加量的增多而增加，相反，在0．13%添加量時，其增重率略小于對照組，原因可能是過高劑量的混合性維生素加重了幼參代謝負擔，同樣在中國明對蝦[23]、斑節對蝦仔蝦[24]、點帶石斑魚[25]等水生動物上也發現過高劑量維生素對生長不再具有促進作用。

3．2　復合維生素對海參幼苗腸道酶活性的影響

腸道中的微生物對腸道組織的形態、代謝以及功能有很大的影響[26]，同時消化系統對有關營養物質的消化和吸收能力又緊緊依賴于腸道中微生物的種類以及數量。建立良好的腸道微生物的區系,很有助于提高生物的生產性能及其飼料利用率。近年來關于調控水產動物腸道菌群的報道有很多，例如：在對蝦的飼料應用中，Sung等[27]用芽孢桿抑制了斑節對蝦哈維氏弧菌（Uharveyi）的生長，降低腸道弧菌數，從而為建立正常的有益微生物區系提供了條件。Mussattoo等[28]通過用寡糖提高揮發性脂肪酸的含量從而降低腸道pH值來抑制致病菌的生長，進一步刺激雙歧桿菌和乳酸桿菌的生長。這些報道說明腸道的健康不僅對促進機體生長有很好的作用，而且在控制疾病方面也有很好的療效，特別是對于只有簡單消化系統的生物來說更是尤為重要。在該試驗中，通過利用不同濃度的混合性維生素復合維生素添加到飼料中飼養海參幼苗，結果顯示消化酶和吸收酶活性都發生了相應的變化。

在消化酶指標中，對照組淀粉酶活性始終高于其他組，且第五組最低。這個結果可能是由于混合性維生素中的一些成分影響了蛋白酶的活性，具體的影響途徑還有待進一步研究。在蛋白酶活性測定結果中，發現經過30 d、60 d的飼養蛋白酶活性的最高值分別在第四組和第六組中。這個結果表明當復合維生素的濃度在0．09%左右時能夠有效地增強蛋白酶的活性。

在吸收酶指標中，在30 d時，對照組的Na+,K+－ATPase酶活性顯著高于其他組，但第三組卻又顯著低于其他組。在60 d時對照組刺參組織中Na+,K+－ATPase吸收酶的活性較30 d初始酶活性有下降，但在60 d時第六組吸收酶活性顯著高于除第四組外的其他各組（P＜0．05）而且第四組是最低的。這種變化說明復合維生素在一定程度上影響了Na+,K+－ATPase酶活性，但是相對于30 d的養殖時間，60 d的效果更好些。

3．3　復合維生素對海參幼苗抗氧化指標的影響

動物的機體內存在著大量的不飽和脂肪酸，當它們被具有強氧化能力的游離基化合物攻擊時將發生過氧化反應從而生成過氧化物。此反應是一種連鎖式的反應，它一旦開始就將會與周圍各種細胞膜上的脂質雙分子層內所包含的脂質或著其他的細胞器產生反應，從而影響有關器官的正常代謝功能或著是其受損時的自我修復功能。生物機體對脂質的過氧化反應損傷有兩種防御體系：一類是非酶促反應，包括酚羥基化合物、輔酶Q、維生素和醇類等；另一類就是酶促反應，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（CAT）等。它們都可以有效清除活性氧并終止自由基鏈式反應，在這個抗氧化系統中CAT、SOD、AOC和MDA是主要參與抗氧化的酶。SOD主要作用于超氧自由基的歧化反應，同時在維持機體體內活性氧的動態平衡、增強吞噬細胞的防御能力等中起著關鍵性作用；CAT是過氧化物酶體的標志酶，約占過氧化物酶體酶總量的40%，它的作用主要是催化過氧化氫分解；T－AOC是指機體中存在的多種抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，他們清除體內產生的各種活性氧，阻止活性氧誘導的氧化應激（oxidative stress）的產生的能力。MDA指標直接反映機體內脂質過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，SOD活力的高低間接反應了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反應了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度[29－32]。盡管到目前為止，有許多研究者都發現了維生素能有效地影響動物體內的抗氧化系統，但是卻仍然沒有一個統一的結果。Lygren等[33]的試驗結果顯示維生素E對大西洋蛙（Salmo sala L.）體內的抗氧化酶沒有顯著影響。但是，萬敏等[34]研究表明飼料中添加VE能有效提高皺紋盤鮑體內的抗氧化能力。而該研究結果發現，對于刺參幼苗的抗氧化酶系統來說，復合型維生素復合維生素對這些指標都有顯著性的影響。對于CAT活性來講，在養殖30 d時后CAT的活性在第二組顯著高于其他組（P＜0．05），而第五組的酶活性又達到最低值。但是經過60 d的飼養后CAT酶活的最高值出現在了第六組，最低組出現在了對照組。對于AOC酶的活性，在養殖30 d后第一組的酶活性顯著高于其他組（P＜0．05），而在60 d時第五組的酶活性又是最高的且顯著高于其他組（P＜0．05）。在30 d時MDA含量在第六組最高且將近是最低組的兩倍，而在60 d時MDA含量在第六組達到最大值。對于SOD來講，它的最大值都發生在第四組，而最低的酶活性卻不是在同一組。產生這些結果的原因可能是由于研究的動物器官組織、飼喂方式及生態養殖條件不同[35]。但是總的來講，隨著復合維生素的添加量的變化抗氧化酶活性也都發生了改變，這與萬敏等[34]在皺紋盤鮑研究中顯示出的維生素能夠影響抗氧化酶活性的結果是一致的。

3．4　復合維生素對海參幼苗免疫力的影響

溶菌酶是非特異性免疫系統中的重要成員之一，其作用機制主要是通過溶解細菌細胞壁中的膚聚糖成分，從而破壞細菌的細胞壁，使細胞死亡，其作用位點在N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸之間的β－1,4糖苷鍵[36]。在海參中，溶菌酶除了有防御病害的作用外[37]，還有消化和濾食海洋細菌的作用[36]。目前，大量研究結果已表明維生素可以很顯著提高多種魚類血清中溶菌酶的活力，但是尚無關于維生素對海參幼苗溶菌酶活力影響的報道。該研究表明飼料中添加維生素可以刺激海參幼苗的非特異性細胞免疫，提高體腔液中溶菌酶的活力。其中，第四組的維生素在30 d和60 d時可以提高溶菌酶的活力，繼續增加飼料中復合維生素的添加量，30 d的海參幼苗的溶菌酶活力反而有所降低。該試驗結果類似于維生素對中華鱘血清中溶菌酶的影響[38]。而在試驗第60 d時，試驗組投喂低濃度和高濃度的復合維生素的飼料溶菌酶活力都產生了降低現象。以上試驗結果說明，中低濃度的復合維生素在短期內飼喂可以迅速升高溶菌酶的活性，而高濃度的復合維生素，對免疫活力的提升效果較為緩慢。

4　小結

該試驗以復合維生素為研究對象，考察其對海參幼苗生長性能、腸道酶活性和免疫功能的影響，通過研究得所得結論如下。

適當量的復合維生素可顯著提高海參的生長性能、腸道酶活性和免疫功能，添加量為0．09%時達到最高。

用復合維生素拌料后，試驗組餌料系數顯著降低，添加量為0．09%時最低，超過0．09%后又隨之上升。

試驗過程中，試驗組的成活率、吃料情況、生長性能、腸道酶活性和免疫功能要好于對照組。

規格在2 000頭/kg以上的大苗推薦用量為0．07%～0．09%，小苗建議用量控制在 0．07%以下，在0．05%左右最好。