流式細胞術檢測血小板相關抗體在特發性血小板減少性紫癜診治中的意義

劉明偉，王飛

（佛山市第一人民醫院，廣東528000）

流式細胞術檢測血小板相關抗體在特發性血小板減少性紫癜診治中的意義

劉明偉，王飛

（佛山市第一人民醫院，廣東528000）

目的探討流式細胞術檢測血小板相關抗體在小兒特發性血小板減少性紫癜（ITP）診治中的臨床意義。方法選擇2012年1月1日至2013年12月31該院兒科住院部收治的臨床診斷為ITP的患兒50例，常規檢查血小板計數，并采用流式細胞術檢測血小板相關抗體（PAIgG、PAIgA、PAIgM），觀察PAIgG、PAIgA、PAIgM與血小板計數的相關性。經治療2周后，分別比較不同治療效果的患兒治療前后各血小板相關抗體的表達水平。結果所有患兒PAIgG、PAIgA、PAIgM表達水平與血小板計數之間均呈負相關（γ=-0.71、-0.66、-0.82，P＜0.05）。療效滿意患兒治療后各血小板相關抗體表達水平較治療前明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；療效不佳患兒治療后各血小板相關抗體表達水平較治療前降低不明顯，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論血小板相關抗體可作為ITP診斷的輔助指標，同時檢測治療前后的變化可用于評估預后及病情監測；流式細胞術可快速、有效、準確地測定血小板相關抗體的表達水平。

血小板/免疫學；血小板計數；紫癜，血小板減少性，特發性；流式細胞術

特發性血小板減少性紫癜（ITP）是小兒最常見的一種免疫性出血性疾病，主要是由于患兒產生了抗血小板自身抗體而引起血小板破壞過多，并抑制巨核細胞產生血小板，引起皮膚、黏膜出血[1-2]。該病的發病與免疫機制有關，血小板相關抗體起著極其重要的作用，因此，血小板相關抗體檢測在ITP的診斷中具有較高的價值。與其他檢測方法相比，流式細胞術有靈敏度高，所需標本量少，分辨率高，方法快捷、準確等優點[3]。因此，本研究的意義在于采用流式細胞術檢測ITP患兒血液中血小板相關抗體表達水平，探討上述指標在該病診斷及治療中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2012年1月1日至2013年12月31日本院兒科住院部收治的臨床診斷為ITP的患兒50例為研究對象，其中男29例，女21例；年齡最大12歲，最小2個月。

1.2 方法

1.2.1 治療方法（1）如患兒血小板計數大于或等于20×109L-1，無內臟出血體征，給予甲潑尼龍注射液2 mg/（kg·d）治療，待血小板升至正常后改為甲潑尼龍片2 mg/（kg·d）口服，治療2周時復查血小板計數及血小板相關抗體。（2）如患兒血小板計數小于20×109L-1，或有內臟出血體征，則給予大劑量甲潑尼龍20mg/（kg·d），最大劑量不超過1 g，治療3 d后改為甲潑尼龍片2 mg/（kg·d）口服，同時加用丙種球蛋白400 mg/（kg·d），連用5 d，治療2周時復查血小板計數及血小板相關抗體表達水平。

1.2.2 檢測方法入院后常規檢查血小板計數，并采用流式細胞術[FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）]檢測血小板相關抗體表達水平，包括PAIgG、PAIgA、PAIgM，具體方法如下。（1）血小板的富集：ACD抗凝血1 mL，150×g離心5 min，取上清液400 g離心10 min，PBS洗2次后，懸浮細胞，調整細胞濃度為5×106mL-1。（2）直接免疫標記：取4支試管，分別加入4種免疫球蛋白抗體及CD61-PE、100 μL血小板懸液，室溫孵育30 min，PBS洗1次，置4℃冰箱待測。（3）流式細胞儀分析：FACS Calibur流式細胞儀氬離子激光器，激發波長488 nm，使用軟件CellQuest。在CD61/SSC散點圖中，圈出CD61+血小板細胞群體，收集并分析此群體細胞20 000個。根據CD61設門，以陰性對照管調整電壓，然后檢測標本PAIgG、PAIgA、PAIgM。

1.2.3 療效判定療效滿意：出血癥狀消失，持續至治療足2周時血小板計數大于50×109L-1；療效不佳：出血癥狀減輕，但至治療足2周時血小板計數小于50×109L-1。

1.2.4 觀察指標觀察所有患兒血小板相關抗體表達水平及血小板計數；分別比較療效滿意和療效不佳患兒治療前后血小板相關抗體的表達水平。

1.3 統計學處理應用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，經驗證樣本資料均符合正態分布且方差齊性后采用t檢驗、方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義，用直線回歸相關分析比較兩因素之間的相關性。

2 結果

2.1 治療效果療效滿意患兒共39例，其中年齡最大10歲，最小2個月；男21例，女18例。療效不佳患兒共10例，其中年齡最大12歲，最小2歲；男7例，女3例；另有1例男性患兒治療未足2周，自動出院。

2.2 ITP患兒治療前PAIgG、PAIgA、PAIgM表達水平與血小板計數的相關性所有患兒PAIgG、PAIgA、PAIgM表達水平與血小板計數之間均呈負相關（γ=-0.71、-0.66、-0.82，P＜0.05）。

2.3 不同療效患兒治療前后血小板相關抗體表達水平比較療效滿意患兒治療后各血小板相關抗體表達水平較治療前明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；療效不佳患兒治療后各血小板相關抗體表達水平較治療前降低不明顯，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同療效患兒治療前后血小板相關抗體表達水平比較（±s）

表1 不同療效患兒治療前后血小板相關抗體表達水平比較（±s）

注：與同組治療前比較，aP＜0.05。

組別治療滿意組nPAIgGPAIgMPAIgA治療不佳組時間治療前治療后治療前治療后39 39 10 10 36±18 12±5a39±17 32±4 33±8 11±4a36±7 21±3 15±10 12±4a18±9 15±3

3 討論

ITP是一種獲得性自身免疫性疾病，患兒體內產生了針對血小板和巨核細胞膜表面糖蛋白的自身抗體，過度破壞血小板的網狀內皮系統或補體系統，從而使外周血血小板減少，臨床上即表現為出血。ITP可分為急性和慢性，急性患兒半數以上于發病前3周內有病毒感染病史，起病迅速，主要表現為自發性皮膚與黏膜出血。根據血小板下降程度可分為輕度：血小板50×109～100×109L-1，只在創傷后出血；中度：血小板25×109～50×109L-1，尚無廣泛出血不止；重度：血小板10×109～25×109L-1，見廣泛或創傷處出血不止；極重度：血小板小于10×109L-1，自發性出血不止危及生命，甚至顱內出血[1]。

其發病機制尚不清楚，ITP患兒血小板相關抗體的異常表達說明由于自身血小板抗原變異，刺激機體在產生相應抗體的過程中，多株B淋巴細胞被激活而產生多種抗體，共同介導破壞血小板，從而引起血小板減少[2-3]。

目前國內該病的診斷主要依靠患兒的臨床表現、血常規、骨髓檢查并排除其他自身免疫性疾病及淋巴瘤、甲狀腺功能亢進、肝臟疾病、脾功能亢進、藥物等因素引起的繼發性血小板減少癥。然而骨髓穿刺檢查，部分患兒家長不愿接受甚至抗拒，而血小板生存時間的測定操作復雜，難以在臨床上廣泛應用，因此，血小板相關抗體表達水平的檢測在該病的診斷中顯得尤為重要。本研究表明，絕大多數患兒中抗血小板抗體表達水平與血小板計數呈負相關，即抗血小板抗體水平越高，血小板減少的程度越嚴重，并且在有效治療后各血小板相關抗體表達水平均顯著下降，提示血小板相關抗體可作為ITP一個重要的診斷指標[4]。

本研究結果表明，療效滿意的ITP患兒體內的血小板相關抗體表達水平較治療前明顯下降，而療效不佳的患兒血小板相關抗體表達水平較治療前無明顯改善，因此，可將血小板相關抗體作為指導臨床治療及監測病情的有效指標。作者認為，血小板相關抗體檢測應作為ITP患兒的常規檢測項目加以重視。

目前檢測血小板相關抗體的方法有微柱凝膠技術、酶聯免疫競爭抑制試驗、流式細胞術、單克隆抗體特異性血小板抗原固定技術等。流式細胞術屬第2代方法，與其他檢測方法相比，流式細胞術具有以下優點：（1）所需采血量少，標本量少。（2）靈敏度高，即使血小板計數很低，也可分析；（3）分辨率高，可檢測亞群表達及弱陽性。（4）方法準確，方便快捷。有研究表明，流式細胞術兼具快速、靈敏、簡便的特點，對小兒ITP的診斷及病情監測均具有較好的實用價值[5-6]。但是，患有系統性紅斑狼瘡、骨髓異常增生綜合征、B淋巴細胞增殖性疾病及Evan綜合征（原發性血小板減少性紫癜并獲得性溶血性貧血）等疾病的患兒，也可能出現血小板相關抗體陽性；如果血清中免疫復合物或免疫球蛋白增高也可以出現血小板相關抗體升高而產生假陽性；多次輸血的患兒可因為同種免疫抗體吸附于血小板表面而導致血小板相關抗體的假陽性[7]。因此，目前尚不能完全依靠血小板相關抗體檢測來診斷該病，與其他抗原特異性血小板抗體檢測、改良抗原捕獲ELISA法、血小板抗原單克隆抗體固相化法等特異性較高的方法聯合應用，可提高血小板相關抗體檢測的敏感性與特異性，從而進一步提高該病的免疫診斷水平[8-10]。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.05.034

:B

:1009-5519（2015）05-0726-02

2014-12-01）

廣東省佛山市醫學科學技術研究項目（2012014）。

劉明偉（1980-），女，廣東佛山人，主治醫師，主要從事兒科臨床工作；E-mail：ssissycn@aliyun.com。

王飛（E-mail：wfei@fsyyy.com）。