臭牡丹總黃酮對A549細胞增殖遷移侵襲力及Wnt通路相關蛋白的影響

余娜 朱克儉 馬思靜 譚小寧 唐皓

摘要 目的：觀察臭牡丹總黃酮對β-catenin過表達A549細胞增殖、遷移、侵襲力以及Wnt通路相關蛋白的影響。方法：選取構建β-catenin真核過表達載體并轉染A549細胞，將其分為6組，分別為未轉染細胞、未轉染細胞+臭牡丹總黃酮、空載組、空載+臭牡丹總黃酮、β-catenin過表達組、β-catenin過表達+臭牡丹總黃酮。MTT法檢測各組細胞的相對存活率，劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力，Transwell小室侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲力。Western Blot檢測各組Wnt通路相關蛋白β-catenin、GSK-3β、P-GSK-3β、c-myc、CyclinD1的表達。結果：轉染β-catenin過表達的A549細胞增殖能力、遷移能力、侵襲力均明顯增強（P<0.05），并顯著上調wnt通路相關因子β-catenin、C-Myc，CyclinD的蛋白表達，下調P-GSK-3β的蛋白表達（P<0.05）。采用臭牡丹總黃酮干預后，能明顯降低各組細胞的存活率，降低細胞向劃痕區域遷移的能力，減少侵襲小室穿過基膜的細胞數（P<0.05）。并下調β-catenin、C-Myc、CyclinD1表達（P<0.05），上調P-GSK-3β表達（P<0.05）。臭牡丹總黃酮的干預作用對轉染β-catenin過表達細胞尤為明顯。結論：轉染β-catenin過表達的A549細胞其增殖、遷移、侵襲力均明顯增強，能激活Wnt/β-catenin通路。臭牡丹總黃酮可抑制A549細胞的增殖、遷移、侵襲力，其機制可能是通過抑制細胞中β-catenin的高表達從而調控下游的一系列因子而起到抑制Wnt/β-catenin通路的作用。

關鍵詞 臭牡丹總黃酮；上皮間質轉化；Wnt信號通路；β-catenin過表達載體

Abstract Objective：To observe the effect of total flavonoids isolated from clerodendrum bungei on proliferation，migration，invasion of human lung adenocarcinoma A549 cell and its effect on the proteins related to Wnt signal pathway.Methods：β-catenin over-expression plasmid was established and A549 cell was transfected.A549 cells were divided into 6 groups：normal A549 cells，normal A549 cells + total flavonoids isolated from clerodendrum bungei group，empty vector group，empty vector + total flavonoids isolated from clerodendrum bungei group，β-catenin over-expression group，β-catenin + total flavonoids isolated from clerodendrum bungei group.MTT assay detected relative survival rate of the cell，and scratch test observed cell migration.Transwell experiment detected the cell invasion.Western Blot was used to detect proteins of the factors that were related to Wnt pathway：β-catenin，GSK-3β，P-GSK-3β，c-myc，Cyclin D1.Results：The proliferation，migration and invasion of A549 cell was enhanced significantly after transfected with β-catenin over-expression plasmid （P<0.05 or 0.01），along with the growth in number of β-catenin，C-Myc and CyclinD which were related to Wnt signal pathway and the decrease of P-GSK-3β.After interfered with total flavonoids isolated from clerodendrum bungei，survival rate of A549 cell in each group declined significantly and the ability of migration and proliferation was decreased （P<0.05）.It down-regulated the expression of β-catenin，C-Myc and CyclinD1 （P<0.05） and up-regulated the expression of P-GSK-3β （P<0.05）.The effect on groups transfected with β-catenin over-expression plasmid were especially obvious.Conclusion：Overexpression of β-catenin could promote the invasion，migration and proliferation in the A549 cell line and activate Wnt/β-catenin pathway，while total flavonoids isolated from clerodendrum bungei could inhibit the invasion，migration and proliferation in the A549 cell line，The pharmacological mechanism is probably inhibiting Wnt/β-catenin pathway through prohibiting the overexpression of β-catenin by regulating its downstream factors.

Key Words Total flavonoids isolated from clerodendrum bungei； Epithelial-Mesenchymal Transition； Wnt signal pathway； β-catenin over-expression plasmid

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.046

原發性支氣管肺癌（簡稱肺癌）是一種發生于支氣管黏膜及腺體的惡性腫瘤，屬于中醫“肺積、肺巖、息賁、虛勞”等范疇。2014年全球癌癥報告顯示，全球引起死亡的最常見癌癥，肺癌居于首位。在我國肺癌的發病率與死亡率均占腫瘤疾病的首位。腫瘤局部復發和遠處轉移是腫瘤病程發生發展的主要原因，80%以上的肺癌患者確診時癌細胞已發生全身侵犯和轉移，進入疾病晚期。臭牡丹是從湖南民間治療惡性腫瘤的單方發掘，并經過反復臨床與科研實踐篩選出來的一味中藥。臭牡丹性平，味辛、苦，歷代本草記載其有“祛風除濕、解毒散瘀、消腫止痛”之功，對多種腫瘤具有臨床治療作用，尤以肺癌為佳。研究表明臭牡丹對多種腫瘤細胞具有抑制作用，并有一定預防肺癌發生及轉移的作用[1-2]。Wnt/β-catenin通路作為一條高度保守的信號通路在發育成熟動物個體中的異常激活，參與腫瘤發生的機制涉及信號傳導、細胞周期、細胞增殖、凋亡以及細胞黏附等多方面[3]，并與肺癌的發生發展密切相關。本實驗采用β-catenin過表達載體轉染A549細胞，并予以臭牡丹總黃酮進行干預，觀察β-catenin過表達載體以及臭牡丹總黃酮對A549細胞增殖、侵襲、侵襲力以及Wnt/β-catenin通路的影響。

1 材料與方法

1.1.1 細胞 人肺腺癌A549購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.1.2 試劑與儀器

β-catenin質粒（pCDNA3.1+載體，AMP抗性），空載體（pCDNA3.1+，AMP抗性），由上海交通大學金衛林教授饋贈。臭牡丹總黃酮由湖南中醫藥研究院附屬醫院中藥房提供臭牡丹生藥，經湖南省中醫藥研究院中藥研究所提取，總黃酮含量65%，1 g相當于生藥30 g。批號：20130720。MTT購自Sigma公司。Transwell小室購自Corning公司。二甲基亞砜（DMSO）購自VETEC公司。RIPA裂解液購自中國北京普利萊。β-Catenin、GSK-3β、P-GSK-3β（Ser9）兔單克隆抗體均購自Cell Signaling Technology公司；C-Myc、Cyclin D1兔單克隆抗體均購自北京博奧森；β-Actin鼠單克隆抗體購自sigma aldrich公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自Proteintech公司。Endo-free Plasmid Mini KitI試劑盒購自廣州飛揚生物工程有限公司。Lip2000助轉染試劑購自美國LIFE公司。胎牛血清購自Gibco公司。DMEM培養液，胰酶均購自Hyclone公司。金屬浴Grant-bi公司生產，垂直凝膠電泳系統、轉膜系統、化學發光儀XRS+由BIO-RAD公司生產超凈工作臺，細胞培養箱均由Thermo Scientific公司生產；離心機由eppendorf公司生產；倒置生物顯微鏡由北京中顯恒業儀器公司生產；酶標儀由匯松公司生產。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將細胞分為6組：A組（未轉染細胞），B組（未轉染細胞+臭牡丹總黃酮），C組（轉染空載質粒），D組（轉染空載質粒+臭牡丹總黃酮），E組（轉染β-Catenin過表達質粒），F組（轉染β-catenin過表達質粒+臭牡丹總黃酮組）。

1.2.2 檢測指標與方法

1）細胞培養與質粒轉染：細胞培養：人肺腺癌細胞A549培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃，5%CO2恒溫細胞培養箱中。每2～3天換液1次，待細胞長滿約80%時，0.25%含EDTA的胰酶消化后直接分瓶傳代。A549細胞呈梭形貼壁生長。

β-catenin過表達和空載質粒的轉化、擴增與抽提：常規制備DH5α大腸桿菌感受態，制備感受態細胞，克隆母的基因片段。將紙片質粒β-catenin過表達、空載質粒分別剪下，放到1.5 mL離心管中，加入20～50 μL滅菌水浸潤備用。將制備好的感受態細胞加入準備好的β-catenin過表達和空載質粒溶液50 μL，搖勻后置于冰上30 min。42 ℃水中熱擊90 s，迅速冰浴冷卻3～5 min。另準備EP管1只，加入液體LB培養基1 mL（不含Amp），混勻，37 ℃下恒溫振蕩1 h。取200 μL菌液涂抹在有Amp的培養板上篩選，正面朝上30 min，待菌液被培養基吸收后，將培養皿倒置，置于37 ℃細菌培養箱中，培養24 h。質粒的抽提按E.Z.N.A.Endo-free Plasmid Mini Kit I試劑盒操作，得到的質粒采用nanodrop2000超微量分光光度計檢測濃度。

真核表達載體轉染肺腺癌A549細胞：將A549細胞接種于6孔板中，待細胞生長至80%～90%時，棄原培養液，每孔加入800 μL不含抗生素的含10%胎牛血清的DMEM完全培養基，待轉染。取空載質粒4 μg，β-catenin過表達質粒4 μg，按Lip2000試劑盒步驟轉染A549細胞。將轉染后的細胞置于CO2恒溫培養箱中5 h后，去除原培養基，更換含10%胎牛血清的DMEM完全培養基，繼續培養。

2）MTT法檢測臭牡丹總黃酮對A549細胞增殖活性的影響：MTT法檢測不同濃度臭牡丹總黃酮對A549細胞增殖活性的影響：對數生長期的未轉染質粒的A549細胞株，按5 000個/孔細胞鋪于96孔板。培養6～8 h待細胞充分貼壁后待用。將臭牡丹總黃酮浸膏溶于無菌水中，母液濃度為10 mg/mL。用含4%FBS的DMEM液稀釋母液，配成不同濃度的藥液。臭牡丹總黃酮濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL，共12個濃度。用不同濃度的藥液置換原培養液，每孔終體積200 μL，每組6個復孔，另設無細胞的培養基為空白對照孔。MTT法測活細胞數，測定各孔各孔的吸光度（A值），計算存活率。以上實驗重復3次。將IC50對應的臭牡丹總黃酮濃度作為后續實驗的給藥濃度。存活率=實驗組平均A值/對照組平均A值×100%。

MTT法檢測臭牡丹總黃酮對各組細胞增殖活性的影響：取對數生長期正常A549細胞、轉染空載質粒細胞、轉染β-catenin過表達質粒細胞，按1.3分組，5 000個/孔細胞鋪于96孔板。用無菌蒸餾水將臭牡丹總黃酮浸膏配成濃度為10 mg/mL的母液，再用含10%胎牛血清的完全DMEM培養基配成2 mg/mL的含藥溶液。待A549細胞生長密度達70%～80%時，B、D、F組分別加入含藥的完全培養基，A、C、E組加入不含藥物的完全培養基，每組每孔終體積200 μL，繼續培養48 h，用MTT法測活細胞數。

3）劃痕試驗檢測臭牡丹總黃酮對A549細胞遷移能力的影響：用無菌蒸餾水將臭牡丹總黃酮浸膏配成濃度為10 mg/mL的母液，再用含10%胎牛血清的完全DMEM培養基配成2 mg/mL的含藥溶液。細胞按1.3分組。待細胞生長密度達70%～80%時，B、D、F組分別加入含藥的完全培養基，A、C、E組加入不含藥物的完全培養基，每孔終體積1 mL，于37 ℃，5%CO2環境下培養48 h。待細胞長滿后用100 μL Tip頭沿培養板中軸均勻畫一直線，用DPBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入1%低血清培養基，放入恒溫CO2培養箱繼續培養。分別于0、24、48 h時間點在倒置顯微鏡下觀察刮痕內的細胞，取樣，拍照。結果以各組劃痕培養后的劃痕區域閉合寬度占初始（0 h）劃痕區域寬度的百分比來表示。重復3次實驗，取平均值。

4）Transwell小室侵襲檢測臭牡丹總黃酮對A549細胞侵襲力的影響：制備Transwell小室，吸取Matrigel膠160 μL加入320 μL無血清培養基中，按1∶2稀釋，即得480 μL，每個小室鋪膠60 μL，共制作8個小室。置37 ℃培養箱內60分鐘使膠凝固。吸出小室內殘余液體，每個小室加入70 μL無血清DMEM培養基，37 ℃ 30 min水化基底膜。細胞按1.3分組，將各組細胞常規消化，調整細胞密度至1×105/mL。吸取200 μL到小室上室內，下室加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM，繼續培養6 h。用無菌蒸餾水將臭牡丹總黃酮浸膏配成濃度為10 mg/mL的母液，再用含無血清培養基配成2 mg/mL的含藥溶液。B、D、F組分別加入含藥的完全培養基，A、C、E組加入不含藥物的無血清培養基，每孔終體積200 μL，于CO2恒溫培養箱中培養48 h。棄去小室內培養液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍。用濕棉簽擦盡上室面的Matrigel膠和細胞，丙酮：甲醇=1∶1，固定20 min，PBS洗2遍，用0.5%結晶紫染色5 min，用清水洗3遍上。倒置顯微鏡下觀察，隨機取個5視野計數細胞數，計算均值。以上實驗重復3次。

5）Western blot檢測各組細胞Wnt通路相關蛋白的表達：將細胞分為4組：pcDNA3.1組（轉染空載質粒），pcDNA3.1+CMD組（轉染空載質粒+臭牡丹總黃酮），β-Catenin組（轉染β-Catenin過表達質粒），β-Catenin+CMD組（轉染β-catenin過表達質粒+臭牡丹總黃酮）。待A549細胞生長密度達70%～80%時，加入2 mg/mL的臭牡丹含藥溶液，置于37 ℃，5%CO2環境下培養48 h后進行Western blot檢測。

用預冷的PBS洗滌1次，加入100 μLRIPA裂解液，反復吹打混勻，置于冰上，裂解30 min；將裂解完畢的細胞于4 ℃，12 000 r/min離心15 min，將上清分裝轉移至0.5 mL的離心管中。按照BCA蛋白定量試劑盒繪制蛋白標準曲線，算出蛋白濃度。灌膠、上樣，根據蛋白定量的結果，每孔上樣5 μL已變性蛋白，電泳后轉膜。按β-catenin（92KD），GSK-3β（46KD），P-GSK-β（46KD），C-Myc（49KD），Cyclin D1（32KD），β-actin（42KD）所在位置進行切膠。轉移至PVDF膜，β-catenin約110 min，GSK-3β約60 min，p-GSK-β約60 min，β-actin約60 min，c-myc約60 min，cyclin D1約40 min。載有蛋白質條帶的膜在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉1 h，然后加入含有稀釋一抗（β-catenin 1∶1 000、GSK-3β 1∶1 000、P-GSK-3β 1∶1 000、C-Myc 1∶500、Cyclin D1 1∶500、β-actin 1∶4 000），4 ℃下振蕩孵育過夜。用1×TBST稀釋HRP標記的二抗（Proteintech），稀釋比例1∶3 000，將PVDF膜放入雜交袋中與稀釋完畢二抗共同孵育45～60 min。洗滌后，采用ECL化學發光顯示液曝光。

1.3 統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測臭牡丹總黃酮對A549細胞增殖活性的影響

2.1.1 MTT法檢測不同濃度臭牡丹總黃酮對A549細胞增殖活性的影響 臭牡丹總黃酮處理A549細胞48 h后，MTT檢測細胞活力顯示，A549細胞活力受到明顯抑制，隨著給藥濃度增加，細胞成活率下降，對細胞抑制作用增強，用SPSS 17.0計算其半數抑制率IC50約2.0 mg/mL，將該濃度作為后續實驗的給藥濃度。

2.1.2 MTT法檢測臭牡丹總黃酮對各組細胞增殖活性的影響 轉染空載質粒的細胞與正常細胞比較，增殖活性差異無統計學意義，但β-Catenin過表達組細胞增殖活性明顯提高（P<0.05）；臭牡丹總黃酮可使各組細胞的增殖活性均明顯降低（P<0.05），對β-Catenin過表達組活性抑制尤為明顯（P<0.05）。見圖1、表1。

2.2 劃痕試驗檢測臭牡丹總黃酮對A549細胞遷移能力的影響

給藥48 h后，與正常A549細胞比較，空載組的遷移率差異無統計學意義（P>0.05），但β-Catenin過表達組較空載組遷移率上升（P<0.05）。采用臭牡丹總黃酮干預后，正常A549細胞、空載細胞、β-catenin過表達細胞的遷移能力均明顯降低（P<0.05）。見圖2、表2。

2.3 Transwell檢測臭牡丹總黃酮對各組A549細胞侵襲力的影響

轉染空載質粒的細胞與正常細胞比較，侵襲活性無明顯差異，而轉染β-catenin過表達載體的細胞穿透人工基底膜的侵襲力明顯增強（P<0.05）。臭牡丹總黃酮可使空白組，空轉載體組，β-catenin過表達組細胞的侵襲力均明顯降低（P<0.05）。見圖3、表3。

2.4 Western blot檢測Wnt通路相關蛋白的表達

Western blot分析結果顯示：轉染β-catenin過表達的A549細胞β-catenin、C-Myc、CyclinD1蛋白表達上調（P<0.05），P-GSK-3β蛋白表達下調（P<0.05）。采用臭丹總黃酮進行干預后，空載組的β-catenin、C-Myc蛋白表達下調（P<0.05），過表達組β-catenin、C-Myc、CyclinD1蛋白表達下調（P<0.05），P-GSK-3β的蛋白表達上調（P<0.05）。見圖4。

3 討論

臭牡丹，性寒，具有“祛風除濕、解毒散瘀、消腫止痛之功”，正符合肺癌“化瘀解毒”的中醫治療原則；另一方面臭牡丹具有一定的補益之力，重在補脾肺腎三臟，可治虛勞久咳，這與中醫所認為的肺癌所致肺氣虛不斂而致虛咳，腎氣虛不納氣致虛喘，皆以補肺腎之氣以定咳喘，并且補土生金補益脾氣的治療大法不謀而合，是符合中醫藥治療肺癌用藥原則的中藥之一。臭牡丹現代藥理研究發現具有鎮靜催眠、局麻、鎮痛、抗炎、抑菌、抗腫瘤等作用。本課題組曾采用淋巴瘤Raji細胞與人肺腺癌A549細胞對臭牡丹提取物的黃酮部分、生物堿部分、水提液去黃酮部分、水提醇溶部分4個不同樣品進行抗腫瘤實驗，發現4個樣品均有不同程度的體外細胞毒作用，在綜合考慮4個組分的抗腫瘤強度、提取工藝等情況后，最終確定臭牡丹總黃酮為抗腫瘤有效組分之一，并對其抗腫瘤作用機制進行研究。

Wnt/β-catenin通路參與腫瘤發生的機制涉及信號傳導、細胞周期、細胞增殖、凋亡以及細胞黏附等多方面。Wnt信號通路通過調控β-catenin而發揮作用，當無Wnt/β-catenin信號時，胞質中的Axin復合體處于穩定狀態，β-catenin維持在較低水平。當細胞中存在Wnt信號時，β-catenin即從axin/APC/GSK-3β組成的降解復合物分離，在細胞內積聚并向細胞核內轉移，與TCF/LEF結合，激活下游重要靶基因C-myc、CyclinD1、slug等的轉錄。經典的Wnt通路激活與肺癌的發生發展密切相關[4]。如Kras轉基因小鼠肺組織中的Wnt通路基因上調，可明顯增加腫瘤發生的概率[5]。在肺癌瘤組織中，Wnt通路的相關因子Wnt-1存在過表達[6]。相反，如果下調Wnt信號通路，可促進肺癌細胞的凋亡、抑制腫瘤擴散和異種移植瘤生長，減少細胞活性和侵襲性，誘導表型分化，胞質β-catenin和存活素表達下降，TCF依賴的轉錄活性降低[7-8]。

β-catenin為胞質中一個多功能蛋白，是wnt/β-catenin信號通路途徑中具有轉錄調控活性的關鍵成員，研究證實β-catenin蛋白的過表達、細胞定位變化及基因突變等是肺癌發生的重要原因。如曾凡軍等[9]認為阻止β-catenin蛋白異常表達以防止肺癌的發生、發展可能是治療肺癌的新策略，為肺癌表觀遺傳干預治療開辟一條新途徑。Han等[10]研究表明，舒林酸抑制肺癌細胞增殖及誘導其凋亡的作用是通過抑制β-catenin的轉錄而實現的。

GSK-3β是哺乳類動物胞質內的一個Ser/Thr激酶，GSK3β對腫瘤細胞具有抑癌與促癌的雙重調節作用[11]。GSK-3β的抑癌作用主要表現在其作為Wnt信號通路的一個重要的負調控因子。GSK-3β的失活將在核內外啟動Wnt信號途徑，從而促進腫瘤的發生發展。相反，上調GSK-3β的活性可以抑制Wnt信號從而減少腫瘤的發生[12]。GSK-3β對肺癌主要表現為抑癌作用，表現為GSK3β失活，而GSK-3βpSer9過表達的情況。王革平和陳莉[13]研究發現磷酸化PGSK-3β可促進肺癌的演進過程，與肺癌的分化、分期相關。曾靜等[14]采用免疫組化方法檢測pGSK-3β在111例非小細胞肺癌（NSCLC）患者肺癌組織中的表達，陽性表達pGSK-3β的部分患者平均中位生存時間明顯縮短，認為pGSK-3β陽性表達可作為NSCLC獨立預后的危險因素經證實GSK3β在口腔癌、食管癌、鼻咽癌等多種腫瘤中均起到抑癌作用[15]。C-myc與CyclinD 1 C-myc是決定細胞從G0/G1期進入S期的開關，是較早出現的細胞惡化的分子標志，與肺癌啟動、惡性增生密切相關[16]。正常情況下，c-myc基因不顯示轉錄活性或低水平表達，只有受某些因子激活時，c-myc基因才大量表達，使細胞由靜止期進入增殖期，促進癌細胞的增殖、浸潤與轉移[17-18]。Cyclin D1為原癌基因，其過表達和失調控均可導致細胞，周期調控異常，從而發生腫瘤。β-catenin/Tcf的復合物可直接刺激CDKs的活性，通過cyclinD 1上調促進細胞異常增生。本實驗顯示，β-catenin可以成功轉染A549細胞，轉染后的細胞增殖、遷移、侵襲力均增強，并可通過調控Wnt通路相關因子β-catenin、P-GSK-3β、c-myc、cyclinD1的表達而激活Wnt/β-catenin通路，可證實β-catenin在細胞內的穩定過表達是激活Wnt通路的起始因子。臭牡丹總黃酮可抑制A549細胞的增殖、遷移、侵襲力，并通過調節上述因子的表達，具有抑制Wnt/β-catenin通路的傾向，其作用在β-catenin過表達組尤為明顯。由此可推測臭牡丹總黃酮抗腫瘤的可能機制是通過抑制細胞內β-catenin的過表達從而調節下游多種因子，抑制Wnt通路而起作用。另外，由于GSK-3β在具有促癌與抑癌的雙向調節作用，在本實驗中GSK-3β的蛋白表達在各組差異無統計學意義，而P-GSK-3β則在β-catenin過表達組表現為下調，在臭牡丹總黃酮組表現為表達上調，其內在機制還有待于進一步研究。

參考文獻

[1]胡琦，朱克儉，譚小寧，等.臭牡丹總黃酮對人肝癌HepG2細胞增殖作用的實驗研究[J].湖南中醫雜志，2015，31（4）：166-168.

[2]朱克儉，歐陽劍虹，盧鋁沙，等.保肺飲預防肺癌的臨床流行病學研究[J].中國中醫藥科技，1997，4（6）：332-333.

[3]Fodde，R，Brabletz，T.Wnt/beta-catenin signaling in cancer stemness and malignant behavior[J].Curr Opin Cell Biol，2007，19（2）：150-158.

[4]Vaughan AE，Halbert CL，Wootton SK，et al.Lung cancer in mice induced by the jaagsiekte sheep retrovirus envelope protein is not maintained by rare cancer stem cells，but tumorigenicity does correlate with Wnt pathway activation[J].Mol Cancer Res，2012，10（1）：86-95.

[5]Pacheco-Pinedo，EC，Durham，AC，Stewart，KM，Wnt/β-catenin signaling accelerates mouse lung tumorigenesis by imposing an embryonic distal progenitor phenotype on lung epithelium[J].J Clin Invest，2011，121（5）：1935-1945.

[6]Liang Y，Liu M，Wang P，et al.Analysis of 20 genes at chromosome band 12q13：RACGAP1 and MCRS1 overexpression in nonsmall-cell lung cancer[J].Genes Chromosomes Cancer，2013，52（3）：305-315.

[7]Lee JS1，Hur MW，Lee SK，et al.A novel sLRP6E1E2 inhibits canonical Wnt signaling，epithelial-to-mesenchymal transition，and induces mitochondria-dependent apoptosis in lung cancer[J].PLoS One，2012，7（5）：e36520.

[8]Nakashima，N，Liu，D，Huang，CL，et al.Wnt3 gene expression promotes tumor progression in non-small cell lung cancer[J].Lung Cancer，2012，76（2）：228-234.

[9]曾凡軍，周媛媛，宋新宇，等.β-連環蛋白與抑癌基因ING1蛋白在肺癌組織中的表達[J].疑難病雜志，2012，11（2）：110-112，封3.

[10]Han，A，Song，Z，Tong，C，et al.Sulindac suppresses beta-catenin expression in human cancer cells[J].Eur J Pharmacol.2008，583（1）：26-31.

[11]楊靜，官成濃.GSK-3β對腫瘤細胞的雙重調節[J].中國醫療前沿，2013，8（6）：14-15.

[12]陶麗，盛曉波，劉玉萍，等.GSK-3β活性調節與腫瘤治療[J].中國藥理學通報，2014（6）：741-743，744.

[13]王革平，陳莉.非小細胞肺癌中PGSK-3β、CEA、C-myc表達與臨床病理因素的相關性研究[J].華西醫學，2009，24（9）：2320-2323.

[14]曾靜，邱志新，劉丹，等.pGSK-3β表達與非小細胞肺癌預后關系分析[J].中華肺部疾病雜志（連續型電子期刊），2011，4（6）：462-466.

[15]郭揚，曲國蕃.GSK3β在惡性腫瘤中的作用及研究現狀[J].現代生物醫學進展，2012，12（22）：4390-4392.

[16]Nakashima T，Liu D，Nakano J，et al.Wnt1 overexpression associated with tumor proliferation and a poor prognosis in non-small cell lung cancer patients[J].Oncol Rep，2008，19（1）：203-209.

[17]賴習華，王茂生，陳小萍，等.C-myc與PCNA在肺癌組織中的表達及其意義[J].現代腫瘤醫學，2011，19（8）：1583-1585.

[18]王革平，陳莉.非小細胞肺癌中PGSK-3β、C-myc表達及臨床意義[J].現代腫瘤醫學，2011，19（11）：2224-2226.