刺絡(luò)瀉血對非酒精性脂肪肝模型大鼠瘦素及脂聯(lián)素的影響

曾蕊 魏丹蕾 張博 張書鵬 崔艷枝 趙慧玲

摘要 目的：觀察刺絡(luò)瀉血干預(yù)對非酒精性脂肪肝模型大鼠血清中瘦素及脂聯(lián)素的影響。方法：選取清潔級雄性SD大鼠40只，隨機分為正常組（10只），模型組（10只），易善復(fù)組（10只），刺血干預(yù)組（10只）。選用高脂飲食飼料喂養(yǎng)法建立非酒精性脂肪肝模型。造模8周后，各造模組仍給予高脂飼料飼養(yǎng)，易善復(fù)組給予易善復(fù)0.159 g/（kg·d）灌胃，刺血干預(yù)組予“豐隆”“太沖”穴三棱針刺血，治療4周后取材，觀察4組大鼠肝指數(shù)及肝臟病理變化，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清瘦素、脂聯(lián)素的水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組血清瘦素水平顯著升高，脂聯(lián)素水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，易善復(fù)組及刺血干預(yù)組瘦素水平明顯下降，血清脂聯(lián)素水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與易善復(fù)組比較，刺血干預(yù)組瘦素水平稍高，血清脂聯(lián)素水平則稍低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：刺血干預(yù)可顯著減輕非酒精性脂肪肝大鼠模型肝損傷，其機制可能與降低血清中瘦素水平，上調(diào)脂聯(lián)素水平有關(guān)。

關(guān)鍵詞 刺血干預(yù)；非酒精性脂肪肝；瘦素；脂聯(lián)素；易善復(fù)；肝損傷；高脂飲食飼料喂養(yǎng)法；肝臟病理

Abstract Objective：To investigate the effects of pricking blood therapy on serum level of leptin and adiponectin in non-alcoholic fatty liver model rats， and to explore the mechanism of pricking blood intervention on non-alcoholic fatty liver disease. Methods：Forty male SD rats were randomly divided into normal group （n=10）， model group （n=10）， essentiale group （n=10） and pricking blood group （n=10）. The non-alcoholic fatty liver model was established by high fat diet feed. After 8 weeks of modeling， the model groups were still fed with high-fat diet. Essentiale group was treated with Polyene Phosphatidylcholine Capsules 0.159 g/（kg·d）， and the pricking blood group was treated with pricking blood therapy on Fenglong （ST40） and Taichong （LR3）. The liver index and liver pathological changes were observed after 4 weeks of treatment. The levels of serum leptin and adiponectin were measured by ELISA. Results：Compared with the normal group， the serum leptin level in the model group was significantly increased， and the content of adiponectin was significantly decreased. And the difference was statistically significant （P<0.05）； Compared with the model group， the serum leptin level in the essentiale group and the pricking blood group was significantly decreased， and the content of adiponectin was significantly increased （P<0.05）. The difference was statistically significant （P<0.05）； Compared with Essentiale group， the leptin level was slightly higher in the pricking blood group， and the adiponectin content was slightly lower. The difference was not statistically significant （P>0.05）. Conclusion：This study shows that pricking blood therapy can significantly reduce liver injury in rats with non-alcoholic fatty liver disease. The mechanism may be related to down-regulating the serum level of leptin and up-regulating the adiponectin.

Key Words Pricking blood therapy； Non-alcoholic fatty liver； Leptin； Adiponectin， Essentiale， Liver injury， High fat diet feed， Pathological changes of the liver

中圖分類號：R245文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.039

非酒精性脂肪性肝病（Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD）是指除外乙醇和其他明確的肝損害因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床綜合征[1]，是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝臟損傷[2]。近年來，NAFLD的發(fā)病率正逐步上升，已成為我國最常見的慢性肝病之一[3]。目前研究認為其發(fā)病機制與氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝紊亂、脂肪細胞因子失調(diào)等因素密切相關(guān)[4]。瘦素（leptin，LP）、脂聯(lián)素（adiponectin，ADP）是脂肪細胞分泌的一種細胞因子，其分泌異常與脂肪肝的形成和發(fā)展密切相關(guān)[5]。此病屬中醫(yī)“痰證”“瘀證”“肥氣”“積證”等范疇，痰濕內(nèi)阻，肝郁氣滯為主要病機[6]。多由于肝失疏泄，脾失健運，導(dǎo)致痰濁內(nèi)蘊，濕邪內(nèi)生，血行不暢，進一步引起肝絡(luò)不和，肝脾功能失調(diào)，濕痰瘀互結(jié)于肝而致，臨床多用活血化瘀、祛痰化濕等方法治療[7]。中醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中刺血干預(yù)對治療痰瘀類疾病療效確切，但目前尚未有刺血干預(yù)治療非酒精性脂肪肝病的相關(guān)報道。為探究刺血干預(yù)對非酒精性脂肪肝病的療效及可能的作用機制，本研究以高脂飼料喂養(yǎng)法建立非酒精性脂肪肝大鼠模型，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中LP及ADP的水平作為觀察指標(biāo)。通過觀察實驗4組大鼠血清中的LP及ADP水平的變化，對刺血干預(yù)治療非酒精性脂肪肝模型大鼠血清LP及ADP的影響進行評估，探索“豐隆”“太沖”刺血干預(yù)療法對非酒精性脂肪肝病模型大鼠治療作用的可能起效機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用清潔級健康雄性SD大鼠40只（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK[京]2016-0011），體重180～200 g。所有動物購入后，于清潔級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。利用隨機數(shù)字表制定隨機分組方案，隨機分為正常組10只，模型組10只，刺血干預(yù)組10只，易善復(fù)組10只。采用每籠5只群養(yǎng)，自由飲用去離子水與光照節(jié)律12 L：12 D（7：00-19：00），室溫（22±2）℃，相對濕度保持30%～40%，并保持動物室安靜。（質(zhì)量檢測單位：北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。最近1次質(zhì)量檢測日期：2017年01月24日）。

1.1.2 藥物 高脂飼料（由100 g/L豬油、20 g/L膽固醇和880 g/L普通飼料混合而成，由科澳協(xié)力公司提供）；易善復(fù)膠囊（多烯磷脂酰膽堿膠囊，賽諾菲安萬特（北京）制藥有限公司，批號：D9073），使用前采用去離子水超聲乳化，并配制為含多烯磷脂酰膽堿132.4 g/L的溶液備用。

1.1.3 試劑與儀器 戊巴比妥鈉（Sigma試劑公司，059H0612），碘酒（上海利康消毒高科技有限公司，20140718）；大鼠瘦素（LP）酶聯(lián)免疫試劑盒，大鼠脂聯(lián)素（ADP）酶聯(lián)免疫試劑盒（由上海酶聯(lián)有限公司提供）；小號三棱針。Multiskan MK3型標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀（Thermo Scientific公司）；DEM-3型自動洗板機（北京拓普分析儀器有限公司）；SKP-02.600型電熱恒溫培養(yǎng)箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）；3K18型離心機（Sigma公司），電子秤（HOCKY AD05公司）。

1.2 方法

1.2.1 非酒精性脂肪肝大鼠模型建立與分組 采用陳世清等[8]高脂飼料的制備配方，即喂養(yǎng)由10%豬油、2%膽固醇和88%普通飼料混合而成的高脂飼料。通過高脂飲食8周建立脂肪肝大鼠模型。選用清潔級雄性SD大鼠40只，隨機分為正常組（10只），模型組（10只），易善復(fù)組（10只），刺血干預(yù)組（10只）。

1.2.2 模型評價方法 4組大鼠于第12周取材，快速剝?nèi)∠嗤课坏母谓M織，進行蘇木精-伊紅（HE）染色后，在光鏡下進行肝組織病理變化的觀察，以《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[9]作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，確定造模成功。

1.2.3 干預(yù)手段 正常組大鼠每日以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，至12周。模型組于造模8周后繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料，不給予任何治療，只抓取按壓。刺血干預(yù)組于第8周造模后繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料，并進行治療性干預(yù)：將大鼠放置大鼠固定器中固定，并綁住其四肢便于操作，取雙側(cè)豐隆、太沖（依林文注所著《實驗針灸學(xué)》[10]和比較解剖學(xué)法進行取穴）刺血0.25 mL，進行刺血干預(yù)治療，2次/周，至第12周。易善復(fù)組于8周造模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料，并給予易善復(fù)膠囊灌胃，0.159 g/（kg·d）[11]，同時給予正常組、模型組、刺血干預(yù)組相同體積（1.2 mL/kg）的去離子水灌胃，至12周。

1.2.4 取材

1.2.4.1 血清采集 實驗第12周末，4組大鼠禁食24 h，稱重，使用6%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）進行腹腔注射麻醉后，腹主動脈部位取血，低溫離心進行血清分離，置-20 ℃的冰箱保存。

1.2.4.2 肝臟采集 動物麻醉后，打開腹腔，迅速取出肝臟，稱濕重。每只均取肝左葉取相同部位的肝組織3塊，并將其浸入4%多聚甲醛溶液，固定48 h，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下進行病理觀察。

1.2.5 觀察指標(biāo)與方法

1.2.5.1 肝指數(shù)測定 采血后快速摘取肝臟并稱取其質(zhì)量，計算肝指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器濕重/動物體重。用各大鼠的臟器濕重除以動物體重，即為4組大鼠的肝指數(shù)。

1.2.5.2 肝臟病理結(jié)構(gòu)檢查 取肝左葉，4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色光鏡下觀察，計算機彩色成相系統(tǒng)照相。

1.2.5.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清中LP、ADP的水平 按ELISA試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，4組數(shù)據(jù)以（±s）表示，4組方差齊且數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時用單因素方差分析，組間比較用LSD法，方差不齊或非正態(tài)時用Nemenyi非參數(shù)檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠肝指數(shù)比較 實驗12周后，4組大鼠稱重并進行比較，與正常組比較，模型對照組、刺血干預(yù)組及易善復(fù)組大鼠體重偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。4組大鼠肝指數(shù)比較，與正常組比較，模型組顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），刺血干預(yù)組和易善復(fù)組稍高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；與易善復(fù)組比較，刺血干預(yù)組肝指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 4組HE染色情況 肉眼觀察正常組大鼠肝臟呈鮮紅色，邊緣銳利，表面光滑；模型組肝臟體積增大，邊緣變鈍，呈土黃色，切面呈油膩狀；刺血干預(yù)組以及易善復(fù)組部分肝臟接近正常，表面呈淺黃色，油膩狀相對減輕，指壓有彈性。HE染色顯示：正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細胞形態(tài)大小均正常，無變性、壞死、炎性細胞浸潤及纖維組織增生。模型組大鼠肝細胞的胞質(zhì)內(nèi)存在大量的呈透明狀的脂肪空泡，且這些脂肪空泡將細胞核擠到肝細胞邊緣，證實病理脂肪肝形成，提示造模成功。刺血干預(yù)組以及易善復(fù)組通過分別接受刺血干預(yù)和藥物治療以后，肝臟脂肪組織變性在一定程度上有所減輕，而肝細胞的結(jié)構(gòu)基本趨于正常。見圖1。

2.3 4組大鼠血清LP、ADP比較 與正常組比較，模型組血清瘦素水平顯著升高，脂聯(lián)素水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，刺血組及易善復(fù)組瘦素水平明顯下降，血清脂聯(lián)素水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與易善復(fù)組比較，刺血組瘦素水平稍高，血清脂聯(lián)素水平則稍低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

NAFLD是當(dāng)前全球面臨的巨大且不斷增長的疾病[12]，也是全球日益普遍的慢性肝病[13]。目前本病的治療主要包括基礎(chǔ)治療，例如改變生活方式[14-15]，減少體重，適當(dāng)運動和適度限制熱量的飲食等[16]，藥物治療包括保肝藥物治療和降脂藥物治療，其中聯(lián)合使用胰島素增敏劑和保肝藥物或抗炎抗纖維化藥物是當(dāng)前治療NAFLD有前景的方向[17]。易善復(fù)作為臨床常用藥治療非酒精性脂肪肝，其作用于肝細胞，通過與肝細胞膜及細胞器膜相結(jié)合，可以加速體內(nèi)脂肪分解以減少脂肪在體內(nèi)積聚。通過直接影響膜結(jié)構(gòu)使受損的肝功能和酶活力恢復(fù)正常，促進肝組織再生，調(diào)節(jié)肝臟的能量平衡。

中醫(yī)學(xué)認為本病屬于中醫(yī)“瘀證”“積證”“肥氣”等范疇，肝主疏泄、肝氣郁結(jié)和脾失健運是本病的病機，進而可致痰濕內(nèi)蘊，氣機郁滯，最終導(dǎo)致痰濕瘀積互結(jié)于肝。《素問·肝熱》曰：“肝熱者，刺足厥陰”，太沖既為足厥陰肝經(jīng)輸穴又是原穴，豐隆為“祛痰要穴”，二穴合用可以調(diào)暢氣機，行氣化痰，和肝醒脾，臨床上多用太沖，豐隆治療非酒精性脂肪肝。有研究表明，針刺太沖，豐隆可以通過改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)治療NAFLD[18]。刺血療法早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有相關(guān)記載，又稱瀉血療法、刺絡(luò)瀉血療法，主要指采用三棱針或其他針具刺破身體之細小絡(luò)脈或小靜脈，放出一定量的血液以治療疾病的一種傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)方法[19]。有研究證明通過靜脈放血可明顯降低鐵負荷，有效改善胰島素水平和胰島素抵抗，從而減輕肝臟損傷[20]。

瘦素（LP）是由肥胖基因ob編碼，脂肪細胞分泌的因子，在體重和脂肪量的調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用。而瘦素抵抗亦為肥胖和諸多代謝性疾病的重要發(fā)病因素[21]。LP在肥胖小鼠種能引起體重減輕、增加能量消耗和脂肪酸的氧化，降低食欲和三酰甘油的合成和抗胰島素的脂肪合成作用。近年研究表明，LP在調(diào)節(jié)細胞凋亡中起關(guān)鍵作用，高瘦素水平可能會促進胰島素抵抗，游離脂肪酸（FFA）因胰島素信號傳導(dǎo)的異常在肝細胞中堆積而加重脂肪肝[22]。脂聯(lián)素（ADP）是由脂肪細胞分泌的胰島素敏感性脂肪因子，ADP水平降低是NAFLD及肝功能障礙的獨立危險因子。ADP水平降低NAFLD的發(fā)病機制中起著舉足輕重的作用。LP在促進炎性反應(yīng)及肝纖維化的過程中起主要作用，而ADP能抑制氧化應(yīng)激，使胰島素抵抗及炎性反應(yīng)得到改善。

高脂飼料喂養(yǎng)法是非酒精性脂肪性肝病研究中常用的造模方法，陳世清等[8]通過高脂飼料成功建立了穩(wěn)定的胰島素抵抗模型。胰島素抵抗是導(dǎo)致非酒精性脂肪肝的關(guān)鍵因素，LP與ADP和脂肪組織及脂肪蓄積密切相關(guān)，提示其參與非酒精性脂肪性肝病的病因和發(fā)病機制[23]。本實驗選用高脂飼料喂養(yǎng)8周，制成非酒精性脂肪肝大鼠模型，并采用易善復(fù)和刺血療法進行干預(yù)，實驗結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組血清LP水平顯著升高，ADP水平顯著降低；與模型組比較，藥物組及刺血干預(yù)組LP水平明顯下降，血清ADP水平明顯升高；與藥物組比較，刺血干預(yù)組LP水平稍高，血清ADP水平則稍低。進一步表明刺血干預(yù)可顯著減輕非酒精性脂肪肝大鼠模型肝損傷，有效地減少脂肪的合成，主要表現(xiàn)為減少血清中LP水平，上調(diào)ADP水平，降低肝臟質(zhì)量、肝臟指數(shù)及改善體重，從而減少肝臟脂肪的堆積，達到治療非酒精性脂肪肝的目的。故有關(guān)刺血干預(yù)對非酒精性脂肪肝的保護機制，可能與下調(diào)血清中LP水平，上調(diào)ADP水平有關(guān)。而刺血干預(yù)除了與易善復(fù)有著類似的改善脂質(zhì)代謝異常有關(guān)外，還可能與間接改善IR這一機制密切相關(guān)。本研究表明刺血干預(yù)對NAFLD的形成及進展過程具有延緩作用。李玥等[24]采用刺血干預(yù)治療非酒精性脂肪性肝病67例，臨床總療效總有效率為88.24%，顯示刺血干預(yù)可顯著改善脂肪肝超聲影像學(xué)，顯著降低TG、TC水平，獲得較好療效。

本研究采用“豐隆”“太沖”對非酒精性脂肪肝模型大鼠進行刺血干預(yù)研究刺絡(luò)瀉血對非酒精性脂肪肝病的治療作用，其機制可能是通過提高NAFLD大鼠肝臟內(nèi)脂聯(lián)素水平，降低LP水平，促進機體自身對IR的改善能力，起到減少肝臟脂質(zhì)的沉積，阻止脂肪肝的進展有關(guān)。目前刺血療法推廣較少，其深入治療機制有待進一步研究，刺血干預(yù)作為一個治療非酒精性脂肪肝新的療法，具有不良反應(yīng)低、安全可靠等特點和優(yōu)點，對刺血干預(yù)治療非酒精性脂肪肝病的進一步研究將為NAFLD、胰島素抵抗以及代謝綜合征提供新的治療思路與方法。

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