刺絡瀉血療法對高脂血癥大鼠模型ApoCⅢ及LPL的影響

張博 趙慧玲 魏丹蕾 曾蕊 張書鵬 崔艷芝 曹范錫

摘要 目的：觀察刺絡瀉血療法對高脂血癥模型大鼠載脂蛋白CⅢ（ApoCⅢ）及脂蛋白酯酶（LPL）活性的影響，并探討其作用機制。方法：將34只清潔級雄性SD大鼠分為空白組、模型對照組、立普妥組及刺絡瀉血組，每組8只，以高脂飼料喂養造模，造模持續28 d。第4周造模成功后，各造模組仍給予高脂飼料喂養，空白組不進行任何干預；模型組僅抓取按壓處理，2次/周；立普妥組按照1.8 mg/（kg·d）的劑量給大鼠灌胃阿托伐他汀鈣，2次/周；刺絡瀉血組選取大鼠委中穴及足三里穴穴位附近的血絡，出血量為0.3～0.5 mL，至第8周。第9周腹主動脈取血，采用酶聯免疫吸附法測定ApoCⅢ，采用光譜檢測法測定LPL、TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量。結果：實驗結束后，與正常組比較，模型組ApoCⅢ、TC、LDL-C含量均顯著增高，差異有統計學意義（P<0.05），LPL含量無明顯變化（P>0.05）；與模型組比較，刺絡瀉血組與立普妥組ApoCⅢ、TC、LDL-C含量顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.05），LPL含量無明顯變化（P>0.05）。結論：刺絡瀉血療法可以有效抑制ApoCⅢ活性，降低高脂血癥大鼠TC、LDL-C水平，還不能認為對LPL有干預作用。

關鍵詞 高脂血癥；刺絡瀉血；載脂蛋白；脂蛋白脂肪酶

Abstract Objective：To observe the effects of pricking blood therapy on ApoCⅢ and LPL in hyperlipidemia rats and explore its mechanism. Methods：A total of 34 male SD rats were randomly divided into 4 groups：normal group， model group， lipitor group and blood pricking therapy group， with 8 in each group. Hyperlipidemia model was induced by high fat diet for 28 days. After successful modeling of 4 weeks， each group was still given high fat diet except control group. Rats in normal group didn′t accept any interventions， while the model group was treated with grabbing and pressing， twice per week. The lipitor group was given atorvastatin calciumby intragastric administration with 1.8 mg/（kg·d） each time， twice per week. In the blood pricking therapy group， the superficial vein of Weizhong and Zusanli were selected for 0.3 to 0.5 mL bleeding until the eighth week. Blood was collected from the abdominal aorta on the 9th week， and ApoCⅢ was detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The levels of LPL， TC， TG， HDL-C and LDL-C were measured by spectrophotometry. Results：Comparing with the control group， the level of TC， LDL-C and ApoCⅢ of the model group were significantly increased， and the difference was statistically significant （P<0.05）. No significant changes were seen in LPL （P>0.05）. Compared with the model group， the level of TC， LDL-C and ApoC3 of the blood pricking therapy group and lipitor group decreased significantly， and the differences were statistically significant （P<0.05）. No significant changes were seen in LPL （P>0.05）. Conclusion：Blood-letting therapy can effectively inhibit the activity of ApoC III and reduce the levels of TC and LDL-C in hyperlipidemia rats， but it cannot be considered as an intervention to LPL.

Key Words Hyperlipidemia； Blood pricking therapy； ApoCⅢ； LPL

中圖分類號：R245.31+2文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.036

近年來，隨著人們生活習慣特別是飲食習慣的改變等多種因素的影響，高脂血癥的發病率有明顯増高的趨勢，對我國健康人群血脂水平的調査發現，男女、城鄉人群的TG和T-CHO水平都較以往升高[1]。高脂血癥是AS和冠心病（Coronary Heart Disease，CHD）的獨立危險因素，其中，LDL-C是導致AS的基本因素[2-3]。高脂血癥是危及人類生命和健康的主要疾病之一，是人類健康的隱形殺手，其嚴重性不容忽視。加強對血脂的控制可以降低CHD及其他心血管疾病發生的概率，JAMA雜志曾經發表述評，認為高質量的脂質處理和血運重建同樣重要，降低血脂可以延緩AS的進展[4]。有效數據證明，有效控制血脂異常，能夠降低患者的住院率化及病死率、提高存活率。高脂血癥患者主要推薦藥物治療，雖然西藥的調脂作用療效較好，但一旦停藥則療效減低甚至消失，而長期應用伴有多種不良反應。因此尋找安全、有效、作用持久的方法治療高脂血癥，尤其探索科學合理的治療高脂血癥的臨床治療方案就顯得非常重要。本研究基于刺絡瀉血療法“祛瘀生新”理論[5]，在高脂血癥模型大鼠造模成功后，刺血足三里穴和豐隆穴對模型大鼠進行干預。通過觀察實驗中高脂血癥模型大鼠的載脂蛋白CⅢ（Apo CⅢ）及脂蛋白脂肪酶（LPL）的變化，分析刺絡瀉血療法對高脂血癥模型大鼠Apo CⅢ以及脂蛋白脂肪酶（LPL）的影響，研究刺絡瀉血療法治療高脂血癥的具體機制，為防治由血脂水平異常引起的心腦血管疾病提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性SD大鼠34只，體重（200±10）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2016-0011。在2級動物室（北京中醫藥大學實驗針灸動物室：室溫22 ℃，相對濕度45%）清潔條件下喂養。

1.1.2 藥物 高脂飼料（82.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%豬油、0.2%丙基硫氧嘧啶，5%蛋黃粉和1%膽酸鈉，由北京科澳協力飼料有限公司提供）；立普妥（阿托伐他汀鈣，10 mg/片，輝瑞制藥有限公司（國產），國藥準字H20051407），使用前使用去離子水超聲乳化，配制成1.8 mg/mL的溶液備用。

1.1.3 試劑與儀器 戊巴比妥鈉（Sigma試劑公司，059H0612），碘酒（上海利康消毒高科技有限公司，20140718）；大鼠載脂蛋白C-Ⅲ（ApoCⅢ）酶聯免疫試劑盒（武漢華美提供），大鼠脂蛋白脂酶（LPL）試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒，低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒，總膽固醇（T-CHO）試劑盒，三酰甘油（TG）試劑盒（南京建成提供），小號三棱針，分光光度計（UV-2100尤尼柯）恒溫水浴鍋（HW·SY11-K 北京市長風儀器儀表公司）離心機（3K18 Sigma）標準規格酶標儀（Multiskan MK3 Thermo Scientific），自動洗板機（DEM-3北京拓普分析儀器有限公司），電熱恒溫培養箱（SKP-02.600黃石市恒豐醫療器械有限公司）電子秤（HOCKY AD05）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機數字表法將34只大鼠隨機分為2組，空白組8只，模型組26只。參考Qi Zhang在Application of GC/MS-based metabonomic profiling in studying the lipid-regulating effects of Ginkgo biloba extract on diet-induced hyperlipidemia in rats中使用的造模方法對26只大鼠造模。4周后隨機選取2只造模組大鼠腹主動脈取血，檢查血漿中總膽固醇的含量≧5.2 mmol/L[6]，提示造模成功。然后將模型組大鼠隨機分為模型對照組，刺絡瀉血組及立普妥組，每組8只。

1.2.2 干預方法 全部大鼠適應性喂養1周后，空白組：常規飼養8周，不做任何處理；模型對照組：高脂飼料喂養8周，從第4周后開始，去離子水灌胃，2次/周，不做其他處理；刺絡瀉血組：高脂飼料喂養8周，從第4周開始，去離子水灌胃，豐隆，足三里刺血，出血量為0.3～0.5 mL（換算公式為出血量=體重×7.4%×2%），2次/周；立普妥組：高脂飼料喂養8周，從第4周后開始，按照1.8 mg/（kg·d）立普妥灌胃，2次/周。

1.2.3 檢測指標與方法 實驗進行至第8周末，各組大鼠禁食24 h，使用6%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）進行腹腔注射麻醉后，腹主動脈部位取血，低溫離心進行血清分離，置-20 ℃的冰箱保存，待用于ApoCⅢ、LPL、TC、TG、HDL、LDL的檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學處理。各組數據以均數±標準差表示，各組方差齊且數據符合正態分布時用單因素ANOVA檢驗，組間比較用LSD法，方差不齊或非正態時用Welch檢驗或Nemenyi非參數檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血脂4項的比較 實驗8周后，各組大鼠血脂四項進行比較，與空白組比較，模型對照組的總膽固醇及低密度脂蛋白顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），刺絡瀉血組和立普妥組稍有升高，差異無統計學意義（P>0.05），與立普妥組比較，刺絡瀉血組總膽固醇及低密度脂蛋白差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠ApoCⅢ及LPL的比較 實驗8周后，各組大鼠進行比較，與空白組比較，模型對照組的ApoCⅢ含量顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05），刺絡瀉血組和立普妥稍有升高，差異無統計學意義（P>0.05），與立普妥組比較，刺絡瀉血組ApoCⅢ差異無統計學意義（P>0.05），各組LPL含量無明顯差異，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

3 討論

國家衛生與計劃生育委員會2015年初發布的《中國居民營養與慢性病調查報告》[7]顯示，2012年中國成人血脂異常患病率40.40%，比較2002年的患病率水平出現大幅度增加，其中高膽固醇血癥患病率4.9%，高脂血癥的患病率13.1%，低高密度脂蛋白膽固醇血癥的患病率33.9%，呈現為國民血脂異常的普遍暴露狀態。

臨床上血脂檢測的基本項目為TC、TG、LDL、HDL。國內外血脂異常防治指南均強調，LDL在AS的發病中起著核心作用，因此推薦LDL為首要干預靶點[3，8-9]，膽固醇占LDL比重的50%左右，故LDL-C濃度基本能反映血液LDL總量，那么以LDL-C作為評估一種治療方法對于高脂血癥的干預效果指標，無疑是合適的。在本次實驗中，我們發現刺絡瀉血療法的確對高脂血癥有明確的治療效果，而戰慧敏[10]等在刺絡瀉血對高脂血癥模型大鼠血脂、NO及ET-1影響的研究中也明確了，刺絡瀉血療法對于高脂血癥模型大鼠的血脂有明確的干預作用。為探究該療法如何調控大鼠體內的LDL，本實驗選取了ApoC3及LPL作為研究目標。通過本次實驗，發現刺絡瀉血療法能明顯降低ApoC3的含量，但是對于LPL無明顯調節作用。

載脂蛋白CⅢ（Apolipoprotein CⅢ，Apo CⅢ）是脂蛋白代謝的重要調節蛋白之一，其主要作用是抑制具有水解血漿三酰甘油（Triglyceride，TG）功能的脂蛋白酯酶活性，并可干擾受體依賴或者非依賴途徑的肝臟對富含TG脂蛋白的攝取，并可促進極低密度脂蛋白（Very Low Density Lipoprotein，VLDL）在肝臟的組裝和分泌。Apo CⅢ抑制富含TG的脂蛋白（TRLs）的分解和清除。無論是在體內還是在體外CM和VLDL中Apo CⅢ可以抑制肝細胞對CM和VLDL的攝取。Apo CⅢ抑制脂蛋白ApoB和肝細胞上的ApoB或ApoE受體的結合。Apo CⅢ的這種抑制作用是由于Apo CⅢ對ApoB或者ApoE的受體區域的掩蓋。Apo CⅢ也可以抑制脂蛋白酶（LPL）的活性，并且在高TG血癥的患者中，Apo CⅢ也是LPL的一個明確的抑制劑。缺乏Apo CⅢ的受試對象TRL水平較低，來自這些受試對象的血清可以激活人奶中的LPL，但是正常的血清可以有效地抑制LPL的活性。這些發現表明Apo CⅢ是通過抑制LPL介導的TRLs的脂解作用導致高TG血癥的發展。

ApoC3能促進VLDL的組裝與分泌，而LDL正是從VLDL轉化而來，并且ApoC3能抑制LDL被干細胞膜上LDL受體的攝取，從而導致血液中LDL的升高，這正與本次實驗的數據相符合。說明刺絡瀉血療法可能是通過抑制血漿中ApoC3的含量，間接的調控血漿中LDL的含量，并且可能對LDL的含量有直接的調控作用。本次實驗中，并未體現LPL的含量有明顯的變化，在與空白組比較，模型組、刺絡瀉血組、立普妥組中，LPL的含量變化基本一致，差異無統計學意義。

LPL全稱為三脂酰甘油蛋白脂酰基水解酶（Triacylglyc-roprotein Acylhydrolase），是由LPL基因編碼的糖蛋白。1966年由Scanu在高密度脂蛋白研究中命名。成熟LPL是由448個氨基酸組成的糖蛋白，相對分子質量為55 000。LPL蛋白以單體和二聚體2種形式存在，活性形式為通過非共價鍵結合形成的同二聚體，其催化中心由Ser132、Asp156、His241組成，LPL的酶活性必須由輔因子載脂蛋白CⅡ（apoCⅡ）激活，載脂蛋白CⅢ（ApoCⅢ）則抑制LPL酶活性。健康人血漿中LPL活性低，靜脈注射肝素后血漿中LPL活性明顯增加。LPL主要由脂肪細胞、心肌、骨骼肌等肝外實質細胞合成分泌，釋放入血后，借助硫酸肝素等葡糖胺聚糖結合在毛細血管內皮上。LPL的生物作用復雜，血漿中LPL是TG代謝的限速酶，LPL的二聚體水解血液中富含TG的乳糜微粒和極低密度脂蛋白，生成的甘油、脂肪酸可供組織氧化分解并提供能量；LPL將脂蛋白結合到血管壁上，促進TG的水解及脂蛋白顆粒的攝取；LPL還可作為LDL受體的配體；LPL參與磷脂和載脂蛋白向高密度脂蛋白的轉移。LPL含量或者活性的改變可通過影響TG代謝進而影響到高脂血癥的發病。

Heller[11]等報道阿托伐他汀未改變高脂血癥個體LPL活性，表明此藥物降低TG不是由此酶加強對TG飽和脂蛋白的分解作用。Kobayashi[12]等的研究結果表明，21名高脂血癥患者服用阿托伐他汀6周后，血漿LPL未見明顯改變。

通過本次實驗，還不能說明刺絡瀉血療法對LPL有調控作用。通過實驗比較研究發現，與目前臨床使用他汀類降脂藥物比較，所有強化他汀治療的臨床研究結果均表明，數倍增量他汀確實可使AS時間發生危險有所降低，但獲益的絕對值小，且全因死亡并未下降[13]，在臨床上，根據導師的臨床經驗發現，長期服用他汀類藥物的患者，雖然可以有效控制血脂中LDL的含量，但是卻有明顯的食欲減退，乏力，反酸等不良反應，而本療法在有效降低LDL的含量的同時，不僅治療的次數少，而且并未出現其他的不良反應，明顯優于他汀類藥物，缺點在于本療法在治療過程中，不如他汀類藥物降低血脂迅速，如血脂過高，需要快速降低血脂指數，建議優先選擇他汀類藥物治療，并聯合本療法，在后期治療中可以替代他汀藥物，以減輕他汀類藥物的不良反應及停藥后的血脂升高。

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