桑寄生總黃酮對大鼠佐劑關節炎模型的影響

王紅麗 管俊 馮靜 牛源菲 王曉丹 崔瑛

摘要 目的：觀察桑寄生總黃酮（TFHT）對佐劑性關節炎大鼠的藥理作用。方法：雄性SD大鼠，測量1次/7 d足趾腫脹度及進行1次關節評分。第22天給藥后將大鼠處死，取左后足踝關節（除正常給藥組大鼠外）做病理切片觀察；酶聯免疫吸附測定法測定血清中TNF-α、IL-10、IL-6的含量。結果：TFHT高、中劑量組能夠明顯改善佐劑性關節炎組大鼠足趾腫脹程度及大鼠全身癥狀；降低免疫器官系數；降低血清中IL-6、TNF-α的含量，升高IL-10的含量；病理切片顯示踝關節軟骨破壞明顯減輕，滲出物及血管翳生成減少或無；提示桑寄生總黃酮具有顯著的祛風濕和逆轉骨關節破壞的作用。結論：桑寄生總黃酮具有明顯的祛風濕作用，其作用機制與降低血清中IL-6、TNF-α的含量，升高IL-10的含量有關。

關鍵詞 桑寄生總黃酮；佐劑性關節炎；炎性反應因子

Abstract Objective：To study the pharmacological effect of total flavonoids of Herba Taxilli （TFHT） on adjuvant arthritis in rats.Methods：All male SD rats were injected with Freund′s complete adjuvant on the left foot to establish adjuvant joint model.From the beginning of the 9th day of administration，normal group and model group were given 0.5% sodium carboxymethylcellulose （CMC-Na） solution by gavage，while the positive control group was given tripterygium glycosides suspension 1 mg/mL.TFHT high，middle and low dose group were given 360 mg/kg，180 mg/kg，90 mg/kg CMC-Na solution for 22 days.The left rear ankle joint diameter of rats were measured and graded every 7 days from the 15th day of modeling.After 22th day，the rats were sacrificed，and the left hind ankle joints （except the normal administration group） were observed for pathological sections.TNF-α，IL-10 and IL-6 in serum were determined by Elisa.Results：TFHT high and middle dose group significantly improved the degree of swelling of the toes and the systemic symptoms of rats in adjuvant arthritis group； decreased the immune organ coefficient； decreased the levels of IL-6 and TNF-α，increased IL-10 content.Pathological sections showed ankle cartilage destruction was significantly reduced，exudate and pannus formation decreased or even disappered.Pharmacodynamics experiments showed that TFHT had significant rheumatism and reversal of bone and joint damage.Conclusion：TFHT has obvious effects of anti-rheumatism，whose pharmacological mechanisms are related with the reduce of IL-6 and TNF-α，as well as the rise of IL-10 in serum.

Key Words Total flavonoids of Herba Taxilli； Adjuvant arthritis； Inflammatory factors

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.004

風濕性關節炎（Rheumatic Arthritis，RA）是一種病因不可解釋的系統性自身免疫疾病，其特征在于進行性的骨破壞和滑膜炎[1]，對稱小關節腫脹和疼痛為其最具典型的臨床表現[2]。迄今為止，全球約有16億RA患者，患病率為0.5%～1.0%，好發于65歲以上的女性[3]。患者多以關節疼痛為主訴，如未經及時的治療，將會進行性的發展成全身性關節損傷，極大的影響生命質量[4]。RA在中醫學中被歸屬于“痹癥”范疇，痹癥的發病根源于本虛或營衛失和，患者正氣不足，風、寒、濕、熱邪相合成痹，機體受外邪侵襲，經絡阻塞，氣血不調，不通則痛，治當固本祛邪，通絡止痛，用善于祛風濕、止痛的中草藥治療RA具有一定的優勢。

本實驗室前期開展了桑寄生功效物質及歸經研究，發現了桑寄生水煎液對佐劑性關節炎模型大鼠有顯著的治療作用，其中萹蓄苷和槲皮苷為桑寄生祛風濕的重要藥效物質[5]。鑒于萹蓄苷和槲皮苷屬于黃酮類成分，故本實驗以桑寄生的總黃酮部位為對象，遵循中醫藥基礎理論及辨證施治的原則，在類似人RA的佐劑性關節炎模型上對其祛風濕藥效進行觀察和研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠，雄性，180～200 g/只，購于山東朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK（魯）20140007。將大鼠隨機標記，分放于籠中，5只/籠。動物實驗室內溫度調控在22～25 ℃之間，相對濕度調控在40%～50%之間，自由食水飼養，1周后進行試驗。

1.1.2 藥物 桑寄生總黃酮，自制，純度度范圍在56.73%～62.38%之間。桑寄生總黃酮（TFHT）溶液的制備稱取一定質量的桑寄生總黃酮，加0.5%CMC-Na溶液超聲溶解，配制成所需濃度的溶液。雷公藤多苷混懸液的制備取一定質量的雷公藤多苷片（10 mg/片），研碎，加0.5%CMC-Na溶液超聲溶解，配制成質量濃度為1 mg/mL的混懸液。

1.1.3 試劑與儀器 Elisa試劑盒IL-6、IL-10、TNF-α（生產批號：E20160901A，艾萊薩生物科技（上海）有限公司）。弗氏完全佐劑（型號：SLBK7817V，美國SIGMA公司）；無菌生理鹽水、甲醛、羧甲基纖維素鈉均為國產分析純。酶標儀（Bio Tek Instruments，Inc）；低速離心機（型號：DL-5-B，上海安亭科學儀器廠）；多級閃蒸器（型號：JMF-320G，河南金鼎科技發展有限公司）；獨立送風隔離籠具系統（型號：IVC-Ⅱ，蘇州馮氏動物籠具廠）；電熱套（容量：50L，上海樹立儀器儀表有限公司）；足趾容積測量儀（型號：YLS-7C，濟南益延科技發展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 SD大鼠不限食水，自由飲食一周后進行試驗，從4 ℃冰箱里取出弗氏完全佐劑，充分震蕩、搖勻5 min。模型組、陽性組、桑寄生總黃酮各劑量組用75%醫用乙醇消毒后，于大鼠左后足注射0.1 mL弗氏佐劑1次，注射以局部產生白泡為佳，正常組于同樣位置注射0.1 mL生理鹽水。

1.2.2 給藥方法 于造模第9天開始給藥。桑寄生總黃酮高、中、低劑量組灌胃給予桑寄生總黃酮溶液（高劑量：360 mg/kg，中劑量：180 mg/kg，低劑量：90 mg/kg），陽性組給予雷公藤多苷片混懸液（10 mg/kg），正常給藥組給予桑寄生總黃酮溶液（360 mg/kg），正常組、模型組給予0.5%CMC-Na溶液。給藥體積為1.0 mL/100 g，每天早晨1次，連續給藥22 d。

1.2.3 檢測指標與方法

大鼠足趾腫脹度的測量及關節炎指數的計算在每只大鼠的踝關節處同一位置做一標記，使用足趾容積測量儀分別于致炎前及灌胃7 d、14 d、21 d后測定繼發側足趾容積1次（共4次），計算足趾腫脹度，其值用來衡量足腫脹的程度。從致炎后8 d開始，每7天進行1次觀察評分。按五級法來給非致炎側三只肢體關節腫脹進行評分。0級：全身足爪無明顯紅腫；1級：趾關節稍腫；2級：小趾及足趾關節紅腫；3級：足踝以下的足爪紅腫；4級：全足爪紅腫。1級算1分，累計算分，12分為最高分。采用此方法來記錄并評估繼發性關節炎病的產生及關節障礙程度。

大鼠免疫器官指數的計算連續給藥22 d后稱取大鼠重量，給予10%的水合氯醛進行麻醉后，腹主動脈取血后迅速取出脾臟和胸腺，用生理鹽水洗凈臟器表面血污及結締組織，用吸水紙吸干水分并稱重。免疫器官指數=免疫器官重量（mg）/大鼠體重（g）。

關節病理學觀察經腹主動脈取血、取出內臟后，立即剝取踝關節，除去皮毛等結締組織。迅速將踝關節標本放于10%的福爾馬林溶液中固定48 h后用5%稀硝酸溶液進行除鈣處理，更換除鈣液，每日2次。除鈣時間直至針刺入標本后有若空感而停止。除鈣完成后，用蒸餾水沖洗標本上過剩的固定液體，過夜。在室溫條件下，按次序用梯度乙醇進行脫水，至C8H10透明后，經包埋處理后切片，置于預處理過的載玻片上，恒溫60 ℃烤片12 h，進行蘇木精伊紅（HE）染色法染色，顯微鏡觀察并分析。

血清中炎性反應遞質TNF-α、IL-6、IL-10的檢測取血，靜置0.5 h后以轉速為3 000 r/min，4 ℃離心10 min下進行血清分離。分離的血清于-20 ℃條件下保存以備用。按照ELISA試劑盒說明書上的操作步驟操作，以血清內各炎性因子的濃度為橫坐標（X），以所測得的吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線，進行測定。

1.3 統計學方法 所有數據均采用SPSS 20.0統計軟件進行統計學分析，計量資料用平均數±標準差（±s）表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般情況 實驗發現，各組大鼠在注射弗氏完全佐劑（FCA）3 h后，大鼠左后足趾出現明顯的紅、腫、熱等反應，有明顯的碰觸躲避行為；在48 h內腫脹程度達到最大，足趾表面繃緊發亮，持續72 h后，腫脹開始消退；約造模8 d后，致炎側足趾再次出現腫脹；造模13 d后，模型組大鼠出現鼻黏膜出血、耳部紅斑、耳部及尾根部結節等典型的關節外表現；當造模后15 d時，非致炎側（右后足趾）出現繼發性關節腫脹，病情呈進行性發展，受累踝關節出現明顯變形，嚴重者甚至不能活動，伴有毛發暗淡，精神倦怠，飲食量減少，體重降低、脫毛等全身現象。

2.2 大鼠足腫脹度的比較 從致炎后15 d開始，TFHT高劑量組與雷公藤多苷組開始起治療效果；致炎后22 d起，與關節炎模型組比，TFHT高、中劑量組顯著抑制佐劑性關節炎大鼠的繼發性足腫脹程度，并可明顯降低關節炎指數，差異均有統計學意義（P<0.01～0.05），其中以TFHT高劑量組和雷公藤多苷組作用最為顯著。大鼠繼發性足趾腫脹度及致炎后關節炎指數均隨灌胃治療的時間的延長而逐漸下降，說明桑寄生總黃酮劑量與關節炎的治療有一定的相關性。見表1、表2。

2.3 各組大鼠免疫器官系數的比較 與正常組比較，關節炎模型組胸腺、脾臟系數顯著提高，差異有統計學意義（P<0.01）。與關節炎模型組比較，TFHT高、中劑量組的胸腺、脾臟指數均有不同程度的降低，差異有統計學意義（P<0.01～0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-10的比較與正常對照組比較，關節炎模型組大鼠血清中的TNF-α，IL-6的含量明顯升高，IL-10的含量下降（P<0.01）。經給予TFHT治療后，大鼠血清中TNF-α，IL-6的含量明顯降低，IL-10的含量顯著升高。其中TFHT高、中劑量組的治療效果尤佳（P<0.01～0.05）。見表4。

2.5 各組大鼠踝關節病理組織學的差異 在光鏡下觀察各組大鼠踝關節，正常組大鼠踝關節腔結構完好，由較薄的單層滑膜細胞組成，且無滲出物，無軟骨壞死及炎性細胞浸潤。關節炎模型大鼠的滑膜細胞由單層排列轉變為多層排列，增生紊亂異常。關節腔及周邊組織有大量炎性細胞（淋巴細胞為主）浸潤，軟骨結構不完整，斷裂及破壞，伴有軟骨細胞肥大，數目減少，有血管翳生成等現象。TFHT高、中劑量劑量組及雷公藤多苷組大鼠經治療后踝關節軟骨破壞明顯減輕，滲出物及血管翳生成減少或無。這些征象表明TFHT高、中劑量組有顯著的逆轉風濕性關節破壞的作用。

3 討論

3.1 實驗動物的選擇 SD大鼠、wistar大鼠、Lewis大鼠常被用來建立佐劑型關節炎（AA）模型。有研究報道了3種品系的大鼠在誘導關節炎模型上的差異，SD大鼠和Wistar大鼠的患病率和病情進展程度均顯著高于Lewis大鼠，SD大鼠在病情進展程度上明顯高于Wistar大鼠，各品系大鼠性別之間在患病率及病情進展程度上無差別[6]。故本實驗采用SD大鼠來建立AA模型。

3.2 關節炎模型的選擇與建立

美國細菌學家Jules Thomas Freund在上世紀50年代中期，創建了一種免疫性關節炎動物模型，即完全佐劑性關節炎模型（AA）。結核分枝桿菌是一種65 kD分子量的熱休克蛋白，與AA關節軟骨的自身抗原熱休克蛋白60（HSP60）有著相似度極高的結構，它通過分子結合和交叉反應激活來克隆狀態Ⅱ型膠原基淋巴細胞，引起自身免疫反應[7]。AA模型大鼠關節有多發性局部紅腫，炎性反應嚴重可導致關節畸形、活動障礙。病理切片可觀察到滑膜增生性病變，關節及關節軟骨因炎性細胞的浸潤而遭到破壞和侵蝕[8]。

本實驗過程中發現，各組大鼠在注射FCA3 h后，大鼠左后足趾出現明顯的紅、腫、熱等反應，有明顯的碰觸躲避行為。在48 h內腫脹程度達到最大，足趾表面繃緊發亮；持續72 h后，腫脹開始消退；約造模8 d后，致炎側足趾再次出現腫脹；造模13 d后，模型組大鼠出現鼻黏膜出血、耳部紅斑、耳部及尾根部結節等典型的關節外表現；當造模后15 d時，非致炎側（右后足趾）出現繼發性關節腫脹，病情呈進行性發展；受累踝關節出現明顯變形，嚴重者甚至不能活動，伴有毛發暗淡，精神倦怠，飲食量減少，體重降低、脫毛等全身現象。上述表現類似于人類RA。

3.3 陽性對照藥物的選擇 上世紀80年代，中藥雷公藤及其制劑雷公藤多苷片以開始在我國廣泛使用，曾作為臨床上治療類風濕性關節炎（RA）、紅斑狼瘡（SLE）等免疫性疾病的一線用藥，因其具有腎毒性、生殖毒性等不良反應，被限制使用。雷公藤多苷通過降低骨關節內各炎性因子的水平來抑制骨關節的受到RA侵襲的程度[9]。另有研究表明，雷公藤可以促進滑膜細胞的凋亡和調控NO的產生的作用[10]。本實驗預實驗中，給予大鼠較大劑量（20 mg/kg）雷公藤多苷混懸液灌胃后，大鼠對其耐受能力較差，出現了吐藥液等不良反應，故將雷公藤多苷混懸液劑量調整到10 mg/kg，發現大鼠無明顯不良反應，足趾腫脹消散較快，全身癥狀有所改善。因此，雷公藤多苷可以成為桑寄生總黃酮治療RA的陽性對照藥品，有助于抗炎及免疫藥效的評價。

3.4 關節炎模型藥效指標

3.4.1 關節炎模型炎性因子指標 IL-6為一種主要的促炎遞質，廣泛存在于RA患者的血清和滑液，可與膜結合受體、可溶性受體結合，可致滑膜細胞增生過度、促使血管翳生成和關節軟骨破壞等[11]。TNF-α均是由單核或巨噬細胞在病毒感染等作用下合成和分泌的炎性反應遞質，它的升高能破壞關節軟骨、誘發關節結構破壞、促進血管生成和滑膜凋亡[12]。IL-10可以阻止LI-1β和TNF-α的生成，可拮抗RA病情的發展，起到抗炎和抑制免疫的作用。通過抑制TNF的釋放來促進免疫復合物的清除。其降低能增加體內的M1介導促炎細胞因子，導致RA炎性反應的發生[13]。本實驗中，TFHT高、中劑量組能夠明顯降低血清中TNF-α，IL-6的含量及升高IL-10的含量。表明桑寄生總黃酮具有顯著的祛風濕功效。

3.4.2 免疫器官系數對關節炎模型的意義 胸腺、脾臟因含有大量的巨噬和淋巴細胞，均是機體進行細胞免疫及體液免疫的核心器官。因此，在當機體受到炎性反應、腫瘤等侵害時，脾臟、胸腺均會有反應性的增生。胸腺及脾臟的質量變化可以反映某種藥物是否有調節及抑制免疫的作用，因此免疫器官的相對重量的的變化是免疫評價的重要指標。大鼠經注射FCA免疫后，大鼠的胸腺和脾臟均有不同程度的出現腫大。TFHT高、中劑量組均能明顯的降低大鼠的胸腺指數和脾臟指數。提示了桑寄生總黃酮可調節免疫系統，阻止炎性反應的進展。

4 結論

本實驗過程中發現，各組大鼠在注射FCA 3 h后，大鼠左后足趾出現明顯的紅、腫、熱等反應，有明顯的碰觸躲避行為。連續注射一段時間后模型組大鼠出現鼻黏膜出血、耳部紅斑、耳部及尾根部結節等典型的關節外表現，且非致炎側（右后足趾）出現繼發性關節腫脹，病情呈進行性發展，受累踝關節出現明顯變形，嚴重者甚至活動障礙，伴有毛發暗淡，精神倦怠，飲食量減少，體重降低、脫毛等全身現象，類似于人類RA，說明造模成功。致炎后22 d起，與關節炎模型組比較，TFHT高、中劑量組顯著抑制著佐劑性關節炎大鼠的繼發性足腫脹程度，可明顯降低關節炎指數（AI）和免疫器官系數，大鼠血清中TNF-α，IL-6的含量明顯降低，IL-10的含量顯著升高。在光鏡下觀察到大鼠經治療后踝關節軟骨破壞明顯減輕，滲出物及血管翳生成減少或無。關節炎模型大鼠的病理表現均隨灌胃治療的時間的延長而出現好轉，說明桑寄生總黃酮劑量與關節炎的治療有一定的相關性。

綜上所述，TFHT高、中劑量組可以改善佐劑關節炎模型的關節腫脹、具有顯著的祛風濕作用，其作用機理與它可以降低IL-6、TNF-α，升高IL-10的含量有關。

參考文獻

[1]覃勇榮，李宏森，劉旭輝，等.桂西北不同寄主桑寄生科植物總黃酮含量的季節差異[J].河池學院學報，2014，34（5）：1-7.

[2]蘇本偉，張協君，朱開昕，等.RP-HPLC法測定桑寄生中槲皮苷和槲皮素含量的提取方法比較[J].廣西中醫藥，2012，35（4）：53-55.

[3]李永華，蘇本偉，張協君，等.桑寄生及其寄主植物桑樹1-脫氧野尻霉素含量相關性研究[J].中國中藥雜志，2011，36（15）：2102.

[4]王譽霖，張文龍，龍小琴，等.不同寄主植物對桑寄生揮發性成分的影響研究[J].中國民族民間醫藥，2015，24（8）：17-25+32.

[5]蘇娣，梁毅，周欣欣，等.桑寄生有效部位對白血病細胞株K562抑制作用的研究[J].湖北中醫藥大學學報，2011，13（2）：12-15.

[6]張瑾.桑寄生的成分分析及其抗白血病細胞活性部位的篩選研究[D].廣州：廣州中醫藥大學，2011.

[7]葉立新，王繼紅，黃華利.桑寄生對腎性高血壓大鼠血漿β-內啡肽濃度影響的量效作用[J].中國臨床康復，2005，9（27）：84-85.

[8]劉麗娟，周誠.復方桑寄生鉤藤顆粒對高血脂大鼠血壓、血脂的影響[J].中國藥業，2011，20（19）：5-6.

[9]汪寧，朱荃，周義維，等.桑寄生對培養的人HepG2細胞葡萄糖消耗作用的影響[J].中醫藥學刊，2006，24（3）：442-443.

[10]楊再波，楊勝巒，龍成梅，等.桑寄生中總黃酮的含量測定及抗氧化活性研究[J].食品研究與開發，2012，33（3）：120-122.

[11]Jae-Myung Yoo，Ju-Hye Yang，Young Soo Kim，etc.Inhibitory Effect of Loranthus parasiticus on IgE-Mediated Allergic Responses in RBL-2H3 Cells[J].Mediators of Inflammation，2016，2016：75-77.

[12]Jin Bae Weon，Jiwoo Lee，Min Rye Eom，etc.The Effects of Loranthus parasiticus on Scopolamine-Induced Memory Impairment in Mice[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2014，2014：130-134.

[13]Daniel Zin Hua Wong，Habsah AbdμL Kadir，Choy Long Lee，etc.Neuroprotective properties of Loranthus parasiticus aqueous fraction against oxidative stress-induced damage in NG108-15 cells[J].Journal of Natural Medicines，2012，66（3）：97-99.