細辛干預小鼠抑郁的初步研究

溫瀑 李玲玲 牛源菲 潘貝 李玲 崔瑛

摘要 目的：觀察細辛水煎液及揮發油抗抑郁作用。方法：將初篩過的小鼠隨機分為模型組、陽性組、細辛揮發油組，細辛水煎液高、中、低劑量組（2、1、0.5 g/mL）6組，每組小鼠10只，灌胃給藥連續7 d，1次/d，第7天灌胃結束后1 h，進行行為學實驗：小鼠懸尾實驗（TST）、強迫游泳實驗（FST）和開場實驗（OFT），觀察細辛水煎液及揮發油對小鼠抑郁行為的干預作用。結束后處死小鼠，用Elisa法測定小鼠腦內五羥色胺（5-HT）、谷氨酸（Glu），γ-氨基丁酸（GABA）的含量。結果：1）細辛水煎液高劑量及細辛揮發油可使小鼠在懸尾實驗TST中不動時間顯著性縮短（高劑量P<0.01，揮發油P<0.01）；細辛水煎液中劑量及細辛揮發油可使小鼠在強迫游泳實驗FST的不動時間均顯著性縮短（P<0.05）。2）細辛揮發油劑量組和水煎液高、中、低劑量組結果與模型組比較均能顯著增加小鼠腦內GABA的含量（P<0.01）；細辛水煎液高、中劑量組與模型組比較能顯著增高小鼠腦內Glu的含量（P<0.05）；細辛水煎液中、低劑量組與模型組相能顯著增加小鼠腦內5-HT的含量（中劑量P<0.01，低劑量P<0.05）。結論：首次證實細辛水煎液及揮發油具有抗抑郁作用。細辛揮發油和水煎液在小鼠懸尾模型和強迫游泳模型上均表現出抗抑郁作用，細辛水煎劑和揮發油與鹽酸氟西汀作用機制有相似之處。作用機制可能與提高腦內類神經遞質5-HT、Glu、GABA含量有關，尤其是與提高單胺類神經遞質5-HT濃度關系更加密切。

關鍵詞 抗抑郁；細辛；水煎液；懸尾實驗；強迫游泳實驗；開場實驗

Abstract Objective：To observe the antidepressant effect of Radix et Rhizoma Asari decoction and volatile oil.Methods：The screened mice were randomly divided into 6 groups with 10 rats in each group，respectively model group，positive control group，Radix et Rhizoma Asari volatile oil group，Radix et Rhizoma Asari decoction of high，medium and low dose group （2，1，0.5 g/mL）.Each group were intragastric administration for 7 d，1 time a day.1 h after the last administration，the tail suspension test （TST），forced swimming test （FST） and open field test （OFT） were performed to observe the intervention effect of decotion and volatile oil of Radix et Rhizoma Asari on depression behavior of mice.Then the mice were killed，and Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was used to determine the contents of GABA，glutamate （Glu） and 5-HT in the brain of mice.Results：The high dose and the volatile oil of Radix et Rhizoma Asari could significantly reduce the immobility time of mice in TST （P<0.01，P<0.01）.Radix et Rhizoma Asari decoction medium dose and volatile oil could significantly shorted the immobility time of mice in FST （P<0.05）.Compared with model group，the volatile oil and decoction of high，medium and low dose group could significantly increase the content of GABA in the brain （P<0.01），and Radix et Rhizoma Asari decoction high and medium dose group could significantly increase Glu content in the brain （P<0.05）.Radix et Rhizoma Asari decoction medium and low dose group could significantly increase the content of 5-HT in the mouse brain （medium dose P<0.01，low dose P<0.05）.Conclusion：It is the first time to confirm that Radix et Rhizoma Asari Decoction and volatile oil have antidepressant effect.Radix et Rhizoma Asari volatile oil and decoction both shows antidepressant effect on the model of tail suspension and forced swimming in mice，whose mechanism was consistent with that of fluoxetine hydrochloride.The mechanism of action may be related to increasing the content of GABA，Glu and 5-HT，especially is closely related with 5-HT concentration.

Key Words Antidepressant； Radix et Rhizoma Asari； Decoction； Tail suspension test； Forced swimming test； Opening field experiment

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.003

抑郁癥（Depression）又稱抑郁障礙，臨床表現為顯著而持久的情緒低落、行為木僵和悲觀厭世，常伴有嚴重的自殺傾向，是一種情感性精神障礙性疾病，不僅危害患者身心健康，而且給家庭及社會造成沉重的損害，據統計結果顯示，全世界范圍內抑郁癥的發病率近11%[1]，而其中有15%左右的抑郁癥患者死于自殺。經研究統計表明，抑郁癥已經成為中國折磨患者第二大負擔疾病。目前臨床一線的抗抑郁藥主要有以下3類：選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRI）、5-羥色胺和去甲腎上腺素再攝取抑制劑（SNRI）、去甲腎上腺素和特異性5-羥色胺能抗抑郁藥（NaSSA），但均有不同程度的不良反應，且復發率高，臨床上尚無療效好且不良反應小的治療藥物[2-3]。隨著抗抑郁藥物的研究，抗抑郁中藥逐漸引起重視，現已成為抗抑郁藥物研究的熱點[4]。

細辛，為馬兜鈴科植物的的根。味辛，氣溫，歸心、肺、腎經。功效解表散寒，祛風止痛，通竅，溫肺化飲。用于風寒感冒，頭痛，牙痛，鼻塞流涕，鼻鼽，鼻淵，風濕痹痛，痰飲喘咳[5]。細辛始載于秦漢時期，《神農本草經》把細辛列為上品藥材：“主欬逆，頭痛腦動，百節拘攣，風濕痹痛，死肌。久服明目利九竅，輕身長年”。《本草綱目》云：“治口舌生瘡，大便燥結，起目中倒睫，散浮熱”。現代研究發現，細辛的主要有效成分為揮發油，其中丁香油酚甲醚約60%，優藏茴香酮約13%，黃樟醚8%，油精9%，細辛酮6%，細辛醚約2%[6]。現有β-細辛醚有大鼠抗抑郁作用的報道[7]。細辛具有良好的開竅、醒神、解郁作用，然而迄今為止，還未見細辛在抗抑郁方面的相關研究報道。本課題首次開展細辛水煎液及揮發油的抗抑郁作用觀察，為細辛的抗抑郁研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級昆明種雄性小鼠，體重16～22 g，由河南省實驗動物中心提供，動物許可證編號為SCXK（豫）2015-0004。分籠飼養在（20±2）℃的動物實驗室，由專人負責飼養和管理。

1.1.2 藥物 細辛：購于鄭州張仲景大藥房，產地為遼寧，批號：160107，經河南中醫學院藥學院生藥學科陳隨清教授鑒定為馬兜鈴科植物漢城細辛漢城Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai的干燥根，質量符合2015年版《中華人民共和國藥典》要求。

1.1.3 試劑與儀器

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）：天津市光復精細化工研究所，批號：201607280。鹽酸氟西汀片（常州四藥制藥有限公司，批號：201608172）；γ-氨基丁酸（GABA）檢測試劑盒（批號20170202B）；谷氨酸（Glu）檢測試劑盒（批號20170202B）；五羥色胺（5-HT）檢測試劑盒（批號20170202B）；以上試劑盒均為武漢華美生物技術有限公司生產。

ZDHW型調溫電熱套（河北省黃驊市中興儀器有限公司）；JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-16gR型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；萬用電爐（北京中興偉業儀器有限公司）；HX-200型高速中藥粉碎機（浙江省永康市溪華五金藥具廠）；SHB-Ⅲ循環水時多用真空泵（鄭州長城科工貿易有限公司）；KQ-500DV型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海精密實驗設備有限公司）；全自動組織研磨儀（上海凈信科技有限公司）；OFT-100開場活動實驗系統（成都泰盟軟件有限公司）；小鼠IVC獨立送風隔離籠具（蘇州馮氏實驗動物設備有限公司）。LHP-10-H實驗室超純水器（重慶力德高端水處理設備研發有限公司）；微量移液器（上海雷勃分析儀器有限公司）；EL-S電子天平（常州市天之平儀器設備有限公司）；Acculab電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）；

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將80雄性小鼠通過開場實驗初篩，選出自主活動能力正常小鼠60只，將初篩過的小鼠隨機分為模型組、陽性組、細辛揮發油組，細辛水煎液高、中、低劑量組（2、1、0.5 g/mL）6組，每組小鼠10只。

1.2.2 給藥方法

各組藥均以0.5%CMC-Na溶解或混懸至所需給藥濃度，鹽酸氟西汀劑量0.1 mg/mL，細辛水煎液劑量分別為2、1、0.5 g/mL，模型組給予同等體積的0.5% CMC-Na溶液，連續給藥7 d，1次/d。末次給藥后進行行為學實驗。

細辛揮發油的提取揮發油提取采用文獻方法[8]，取細辛粗粉400 g，藥液比1∶10，浸泡1 h，加少許碎瓷片，回流提取2 h，揮發油測定器收集揮發油，得到淺綠色揮發油3.2 mL。細辛揮發油、CMC-Na5%、水配制成1 g/mL的溶液（按生藥量計算，下同），備用。

細辛水煎液的制備采用文獻方法[9]，精密稱取細辛飲片400 g，藥液比1∶10，浸泡1 h。回流提取2 h，殘渣以藥液比1∶8，回流提取1.5 h。合并兩次濾液，濃縮成2 g/mL的溶液，備用。

1.2.3 檢測指標與方法

懸尾實驗（TST）：參照Steru報道的方法[10]，先將檢測懸尾箱、攝像機及計算機連接，開啟計算機，打開懸尾測試軟件，進行實驗各項參數設置，將實驗時間設為6 min。將小鼠尾端后1/3處（在距尾尖部約2 cm處）用醫用膠布粘于懸尾箱（30 cm×30 cm×70 cm）上部支架上，使小鼠成倒掛狀態，頭部離箱底約20 cm。箱內小鼠為了克服不正常體位而掙扎活動，但掙扎一段時間后會出現間歇性不動，顯示絕望狀態。懸掛時間為6 min，僅統計后4 min內懸尾累計不動時間。不動狀態即小鼠停止掙扎不動或輕微晃動或無任何活動。

強迫游泳（FST）：實驗參考Porsolt報道的方法[11]，先將強迫游泳裝置、攝像機及計算機連接，開啟計算機，打開強迫游泳測試軟件，進行實驗各項參數設置，將實驗時間設為6 min。將小鼠單獨放入高40 cm、直徑18 cm的圓柱形透明塑料缸中，缸內水深15 cm，水溫（25±2）℃，從小鼠入水后計時6 min，僅記錄后4 min內游泳累計不動時間。不動狀態指小鼠在水中顯示漂浮狀態或停止掙扎或僅有輕微的肢體運動以保持頭部浮在水面。

開場實驗：參考Archer報道的方法[12]，先將敞箱裝置、攝像機及計算機連接，開啟計算機，打開OFT100軟件，進行實驗各項參數設置，將實驗時間設為3 min。敞箱裝置為長50 cm、寬50 cm、高25 cm金屬箱，開場實驗OFT系統將箱底部從左到右從上向下按順序依此編號為相同大小的1～25個小格，其中7，8，9，12，13，14，17，18和19為中央區域，其余為外周格，13號格為正中格。內面用黑漆涂滿。將小鼠放在測試房間適應1 h后，開始開場實驗，將其放入中心方格內，觀察小鼠在3 min內，運動距離以及停留時間以及站立次數，徹底清潔敞箱后再進行下1只小鼠的觀察。

小鼠腦組織的處理及酶聯免疫法實驗：小鼠行為學測試結束后，立即脫頸椎處死，斷頭迅速剝離全腦，并用十萬天平精密稱重全腦重量；以腦組織（g）：生理鹽水（mL）1∶9的比例加入生理鹽水，用細胞粉碎機進行勻漿粉碎；勻漿液在4 ℃低溫離心機，6 000 r/min離心10 min，取上清液，置5 mL離心管中，即得10%的小鼠腦勻漿液，然后立即進行Elisa法檢測，測定腦組織中5-HT、GABA和Glu的含量[13]。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件對結果進行單因素方差分析，組間采用LSD檢驗，實驗數據以（±s）表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對小鼠懸尾不動時間的影響 與模型組比較，細辛水煎液高劑量可顯著縮短小鼠懸尾不動時間（P<0.01），陽性藥鹽酸氟西汀與細辛揮發油組同樣可顯著縮短小鼠懸尾不動時間（P<0.05），細辛水煎液和陽性藥鹽酸氟西汀在計劃給藥方案內在懸尾實驗TST中均表現出明顯的抗抑郁作用，且細辛中、低劑量對此有縮短趨勢，但差異均無統計學意義（P>0.05）；所以細辛水煎液高、中、低劑量呈現出一定的量效關系。見表1。

2.2 對小鼠強迫游泳不動時間的影響 與模型組比較，細辛水煎液中劑量、細辛揮發油和陽性藥鹽酸氟西汀均可顯著縮短強迫游泳不動時間（P<0.05），提示細辛水煎液和鹽酸氟西汀在既定給藥方案內在小鼠強迫游泳實驗中均表現出明顯的抗抑郁作用。見表1。

2.3 對小鼠開場實驗運動距離的影響 小鼠開場實驗運動距離，各組間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.4 對小鼠腦內5-羥色胺、GABA和Glu含量的影響 小鼠腦內5-羥色胺、GABA和Glu含量，與模型組比較，細辛水煎液中、低劑量組能顯著升高小鼠腦內5-HT的含量（P<0.05）；陽性對照組，細辛揮發油組和水煎液高、中、低劑量組能顯著增加小鼠腦內GABA的含量（陽性組P<0.05，其他組P<0.01）；細辛水煎液高、中劑量組能顯著升高小鼠腦內Glu的含量（P<0.05）。小鼠腦內GABA和Glu含量之間的比值，各組之間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.5 對小鼠體重、腦重及臟器系數比值影響 小鼠的體重、腦重與臟器系數，各組的數值間并沒有受到細辛水煎液和揮發油的影響，每組間互相比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

開場實驗運動距離可客觀的反映小鼠自主活動能力的基本情況[14]，本實驗在懸尾和強迫游泳行為學實驗考察細辛的抗抑郁作用之后，進一步通過開場實驗考察了細辛對小鼠自主活動能力的影響，結果顯示各組之間比較，細辛水煎液及揮發油對小鼠開場實驗中運動距離差異均無統計學意義（P>0.05），從而排除了由于自主活動性可能帶來的抗抑郁的假陽性結果。

懸尾實驗和強迫游泳實驗抑郁癥模型對絕大多數抗抑郁藥敏感，操作簡單、快捷，被廣泛應用于抗抑郁藥物的初篩[15-17]。本研究采用小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗抑郁癥模型，首次考察了細辛水煎液及其揮發油的抗抑郁效果，結果表明，與模型組比較，細辛水煎液高劑量可顯著縮短小鼠懸尾不動時間（P<0.01），陽性藥鹽酸氟西汀與細辛揮發油組同樣可顯著縮短小鼠懸尾不動時間（P<0.05），與模型組比較，細辛水煎液中劑量、細辛揮發油和陽性藥鹽酸氟西汀均可顯著縮短強迫游泳不動時間（P<0.05）。可證細辛水煎液及揮發油確實具有抗抑郁作用，且細辛水煎液高、中、低劑量呈現出一定的量效關系，具有抗抑郁作用。

懸尾實驗和強迫游泳實驗抑郁癥模型確實對抗抑郁藥有高選擇性，但的確存在一些增加動物活動性的藥物會出現假陽性結果[14]。為避免可能出現的假陽性結果，需要同時測定小鼠的自主活動能力，以提高懸尾實驗和強迫游泳實驗方法篩選抗抑郁藥的選擇性和可靠性。在小鼠試養階段結束后，通過開場實驗進行初篩，篩除其中缺乏自主活動能力及活動能力低下的小鼠，棄之不用，將余下的自主活動能力較優的小鼠隨機進行分組，以減小實驗誤差，為而后的測試提高整體實驗的準確性及可靠性，具有抗抑郁作用。

興奮性氨基酸假說描述了腦內存在的氨基酸，不僅是合成多種蛋白質的原料，同時還具有突觸傳遞功能[18]。谷氨酸Glu屬于興奮性氨基酸，在中樞興奮性氨基酸中占主導地位，谷氨酸是中樞神經系統中含量最高、分布最廣、作用最強的興奮性神經遞質。腦組織只能氧化谷氨酸，而不能氧化其他氨基酸，故谷氨酸可作為腦組織的能源物質，改進維持大腦機能，是中樞神經系統的主要興奮性神經遞質[19]。

在中樞神經系統中，最重要的抑制性氨基酸是γ-氨基丁酸，其在腦組織內廣泛存在，是腦內重要的抑制性遞質，只存在于神經組織中，具有高生物活性。1/3以上的抑制性神經傳導由γ-氨基丁酸GABA作為遞質介導，γ-氨基丁酸GABA廣泛分布于大腦皮質、海馬體、丘腦、下丘腦、基底神經結、小腦以及枕葉皮層中。并對機體的多種功能起調節作用[20]。當人體缺乏GABA時，會產生焦慮、不安、疲憊、恍惚、憂慮等不良情緒。本實驗結果顯示，細辛揮發油組和細辛水煎液高劑量組能顯著提高小鼠腦內的γ-氨基丁酸含量（P<0.05）、Glu含量（P<0.05），但GABA/Glu值無統計學意義；表明細辛的抗抑郁作用，不是簡單的提高興奮性氨基酸遞質含量實現的，而有可能是同時提高興奮性氨基酸和抑制性氨基酸遞質含量，從而改善中樞興奮—抑制閾值來實現的。

五羥色胺（5-HT）又名血清素，廣泛存在于哺乳動物組織中，特別在大腦皮質及神經突觸內含量很高，屬于生物原胺類神經遞質，是調節神經活動的一種重要物質。“單胺類假說”是首個抑郁癥的神經生物化學理論[21]，認為體內NE或五羥色胺5-HT相對或絕對不足是引起抑郁癥發生的主要原因。五羥色胺5-HT可調節單胺類神經遞質系統，大腦神經遞質五羥色胺5-HT在神經突觸間的濃度相對或絕對不足，導致整體精神活動和心理功能處于全面低下狀態，從而導致抑郁、焦慮、驚恐、強迫等多種精神障礙[22]。臨床觀察到抑郁癥患者大腦缺少5-HT和NA，許多抗抑郁藥就是通過抑制神經系統對這2種神經遞質的再攝取，使得突觸間隙這2種神經遞質濃度增加而發揮抗抑郁作用[23]。本實驗結果顯示，細辛揮發油組和水煎液高、中、低劑量組能顯著升高小鼠腦內的5-HT的含量（P<0.05），表明細辛可能通過提高5-HT遞質含量，發揮抗抑郁作用。陽性對照藥鹽酸氟西汀屬于選擇性5-HT再攝取抑制抑制劑，能增加突出間隙可供利用的5-HT，從而產生抗抑郁作用。實驗數據顯示，細辛水煎劑和揮發油與鹽酸氟西汀作用機制有相似之處。

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