OPA-FMOC在線柱前衍生高效液相色譜法 測定不同產地燕窩中氨基酸含量

上官國蓮,梁雪琪,黃桂東,黎小鵬,曾巧輝,*

(1.佛山科學技術學院食品科學與工程學院,廣東佛山 528225;2.中山市農產品質量監督檢驗所,廣東中山 528400;3.中山市三鄉鎮農產品檢驗檢測站,廣東中山 528463)

燕窩(edible bird’s nest),雨燕科動物金絲燕及同屬多種金絲燕用唾液和少量羽毛混合黏結所筑成的巢窩,是中國著名的傳統補品[1-2]。研究表明,燕窩中含有豐富的活性唾液酸糖蛋白、礦物質、碳水化合物、維生素及氨基酸等多種天然營養物,有補中益氣、滋陰潤燥等功效[3]。然而,目前市場上燕窩行業并沒有統一的產品標準,質量參差不齊,部分不法商人為得到高額利潤,通過添加明膠、銀耳、蛋清和豬皮膠原等成分來增加燕窩的重量,以次充好,以假亂真[2,4]。為了規范燕窩市場,杜絕劣質燕窩交易,迫切需要建立燕窩關鍵成分分析體系,以期從科學的角度鑒定燕窩真偽及品質。

氨基酸是燕窩的關鍵生物活性成分,其含量、種類及比例是評價燕窩營養價值優劣的主要指標之一[5]。Warasri等[6]研究表明,燕窩中蛋白質含量占60%以上,因此,定量監測分析燕窩氨基酸組成及含量對客觀分析燕窩質量及真偽有重要意義[7]。目前常用的燕窩氨基酸檢測儀器有氨基酸分析儀和高效液相色譜儀(High performance liquid chromatography,HPLC)以及生物探針技術[8]等,氨基酸分析儀采用陽離子交換色譜分離、柱后茚三酮衍生分光光度檢測技術等[9],檢測過程耗時長達1小時,儀器在運行時茚三酮沉淀易堵塞管路,且重現性不理想。液相色譜儀主要采用柱前衍生法和柱后衍生法[10],其中異硫氰酸苯酯(Phenyl isothiocyanate,PITC)[11-14]和鄰苯二甲醛-9-芴甲基氯甲酸酯法(O-phthalaldehyde-9-fluorenylmethyl chloroformate,OPA-FMOC)[15]較為常見,柱前衍生PITC法反應速度慢且易受試劑干擾,而OPA-FMOC法可克服上述缺點,并可同時檢測一級和二級氨基酸,應用相對廣泛,且未見此法在燕窩氨基酸測定中的應用。

本文以燕窩為研究對象,鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde,OPA)和9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)為衍生試劑,通過柱前衍生化法,優化測試條件,建立能同時檢測22種氨基酸的快速檢測方法,采用HPLC結合熒光檢測器對10批次燕窩中22種氨基酸含量進行分析,以期為鑒定燕窩真偽及品質提供科學的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕窩食材 來自馬來西亞(燕盞、官燕碎、白燕碎)、印度尼西亞(官燕碎、白燕碎、燕盞)、泰國(白燕碎、血燕、燕盞、官燕碎),共10個批次,分別標記為樣品1、2、3、4、6、7、5、8、9、10。

硼酸鹽緩沖液、OPA、FMOC、17種氨基酸混標、天門冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸、羥脯氨酸、肌氨酸標準品等 色譜純,安捷倫科技(中國)有限公司;鹽酸、磷酸氫二鈉、苯酚等 國產分析純,sigma-aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;氫氧化鋰 優級純,sigma-aldrich西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;甲醇、乙腈 色譜純,德國默克公司;超純水 Milli Q凈化系統自制。

HPLC(型號1260 infinity II)、可變波長掃描紫外檢測器(Variable wavelength scanning UV detector,VWD)熒光檢測器(Fluorescence detector,FLD)、自動進樣器(型號1329B)等 美國安捷倫公司;Milli Q 凈化系統 德國默克公司;氮吹儀 杭州雪中炭恒溫技術有限公司;十萬分之一分析天平 梅特勒托利多公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑的配制 天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro),17種標準品為混合標準品,每種氨基酸的濃度為1 μmol/mL。

天門冬酰胺(Asn):準確稱取0.14615 g天門冬酰胺標準物質,用超純水溶解并定容到10 mL的容量瓶中,最終濃度為100 μmol/mL,搖勻,4 ℃保存。

谷氨酰胺(Gln):準確稱取0.13212 g谷氨酰胺標準物質,用超純水溶解并定容到10 mL的容量瓶中,最終濃度為100 μmol/mL,搖勻,4 ℃保存。

色氨酸(Trp):準確稱取0.20433 g色氨酸標準物質,用超純水溶解并定容到10 mL的容量瓶中,最終濃度為100μmol/mL,搖勻,4 ℃保存。

羥脯氨酸(Hyp):準確稱取0.13113 g羥脯氨酸標準物質,用超純水溶解并定容到10 mL的容量瓶中,最終濃度為100 μmol/mL,搖勻,4 ℃保存。

肌氨酸(Sar):準確稱取0.08909 g肌氨酸標準物質,用超純水溶解并定容到10 mL的容量瓶中,最終濃度為100 μmol/mL,搖勻,4 ℃保存。

校核標準品:GBW(E)100010小麥粉。

1.2.2 儀器分析條件 本研究通過OPA法衍生一級氨基酸,FMOC法衍生二級氨基酸的柱前衍生法,使用了VWD和FLD兩種檢測器對氨基酸進行檢測,并對兩種檢測器的優劣進行比較。安捷倫自動進樣器條件:參考蘇建坤[16]、徐飛[17]、裴玉[18]等的研究方法,結合本實驗室的實際進行適度改進,形成本研究的OPA-FMOC柱前衍生法,進樣程序設置如下:吸取硼酸鹽緩沖液2.5 μL(瓶1);吸取樣品0.5 μL,在空氣中混合,最大速度,2次;等待0.5 min;用未加蓋瓶中的水清洗針頭(從2號位的瓶子中吸取0 μL H2O);吸取0.5 μL OPA(瓶3),在空氣中混合,最大速度,6次;用未加蓋瓶中的水清洗針頭(從2號位的瓶子中吸取0 μL H2O);吸取FMOC 0.5 μL(瓶4),在空氣中混合,最大速度,6次;吸取32 μL H20(瓶5),在空氣中混合,最大速度,2次;進樣。

檢測器的選擇:VWD檢測條件:0～10.35 min,波長338 nm;10.35 min波長切換至262 nm。FLD檢測條件:0～10.35 min,Ex=340 nm,Em=450 nm,增益為10;10.35 min波長切換到Ex=266 nm,Em=305 nm,增益為9。

色譜柱的選擇:氨基酸的快速檢測參考安芳[19]、王星[20]、陶蓓蓓[21]等的研究方法,并結合實際情況做了適度改進,具體條件如下。色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)和色譜柱Agilent Poroshell HPH-C18(4.6 mm×150 mm,3.5 μm):柱溫45 ℃;流速為1.5 mL/min;進樣量0.5 μL,系統由A(pH8.2,10 mmol/L Na2HPO4水溶液)和B(乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10,V/V/V)兩個通道組成。流動相A的平衡濃度為98%,B為2%;0.35～13.4 min過程中,A的比例降至43%,B的比例升至57%;13.4～13.5 min過程中,A的比例升至57%,B的比例降至43%;13.5～14.0 min過程中,A的比例降為0,B的比例升至100%。

1.2.3 樣品處理 燕窩酸水解前處理方法參照芮鴻飛等[11]的方法進行,稱取燕窩樣品20 mg左右,精確記錄至0.1 mg,加入6 mol/L鹽酸10 mL到50 mL樣品瓶中,加入3～5滴苯酚,用氮吹儀吹掃1 min后,迅速密封瓶口放入110 ℃烘箱水解24 h。冷卻,混勻,開蓋,把酸解樣品過濾到容量瓶中,并用超純水多次洗滌樣品瓶,最終定容到25 mL。

燕窩堿水解前處理方法參照蒲云月等[22]的方法進行,稱取燕窩樣品40 mg左右記錄數據,加入2 mL 4 mol/L氫氧化鋰到20 mL樣品瓶中,用氮吹儀吹掃1 min后,迅速密封瓶口放入110 ℃烘箱水解24 h。冷卻,混勻,開蓋,把堿解樣品過濾到容量瓶中,并用超純水多次洗滌樣品瓶,最終定容到25 mL。

分別吸取上述酸處理和堿處理的樣品各100 μL到樣品瓶中,用超純水定容到1 mL,供上機測定使用。

2 結果與分析

2.1 檢測器選擇

VWD檢測器檢測結果見圖1。FLD檢測器檢測結果見圖2。由圖1和圖2可知,采用VWD檢測氨基酸時候,色譜圖中4～5 min之間隆起一個小包,導致基線不平,對Arg和Ala的定量分析造成一定影響。相對而言,FLD檢測圖的總體響應值比VWD高,且基線平穩,雜質干擾少。同時,由于Lys與Hyp之間切換波長有0.1 min的間隔,若時間小于0.1 min則會出現基線跳躍式波動(圖3),最終對Lys與Hyp的定量分析造成不利影響。因此,在切換波長不小于0.1 min的前提下,本文優先選擇FLD進行后續實驗。

圖1 VWD檢測22種氨基酸的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 22 amino acids with VWD

圖2 FLD檢測22種氨基酸的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 22 amino acids with FLD

圖3 FLD檢測22中氨基酸的色譜圖(Lys和Hyp之間切換波長的時間小于0.1 min)Fig.3 Chromatograms of 22 amino acids with FLD

2.2 色譜柱選擇

不同型號色譜柱Agilent Poroshell HPH-C18(4.6 mm×150 mm 3.5 μm)和Agilent ZORBAX Eclipse AAA(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)對氨基酸的分離效果的檢測結果見圖2和圖4。由圖2可知,脯氨酸是所檢測氨基酸中最后出峰的化合物,HPH-C18柱在14 min內完成所有氨基酸的檢測并得到完全分離。由圖4可知,Asp和Glu、Phe和Ile等氨基酸色譜峰部分重疊,未實現基線分離,且檢測時間超過17 min。因此,本研究優先選取HPH-C18柱進行后續的氨基酸檢測分析。

圖4 Agilent ZORBAX Eclipse AAA柱 檢測22中氨基酸的色譜圖Fig.4 Chromatograms of 22 amino acids equipped with Agilent ZORBAX Eclipse AAA column

2.3 前處理方法選擇

常規水解法(酸水解法)是指在6 mol/L的鹽酸作用下,將樣品中的蛋白質水解成單一的氨基酸,使氨基酸從蛋白的結合狀態中游離出來的方法。在該水解過程中,Trp全部被破壞,無法測量。然而,Trp是蛋白質的重要成分,是人和各種動物生長發育不可缺少的必需氨基酸之一,堿水解法適用于色氨酸的測定[23]。本文發現,在定容過程中,酸水解和堿水解的樣品若同時定容于同一容量瓶中會出現渾濁現象,最終選擇酸水解以及堿水解分開定容,合并兩組定容的樣品,待測。

2.4 線性范圍及相關系數

在以上優化的實驗條件下,各取0.5 μL濃度分別為5、10、20、50、100、200 nmol/mL的標準溶液進樣,記錄色譜圖得出22種氨基酸的線性方程和相關系數,以最低濃度混合標準品逐步稀釋,進樣并分析確定檢出限(LOD),結果見表1。由表1可知,相關系數R2均大于0.998,說明所有的22種氨基酸均呈現良好的線性關系,且檢出限較低。

表1 標準曲線回歸方程及相關系數Table 1 Linear equation of correlation coefficient

2.5 回收率和方法精密度

本文采用兩種加標方法計算回收率,一是使用GBW(E)100010小麥粉進行校核(該標物只標明15種氨基酸的含量);二是采用在已知氨基酸含量的燕窩樣品中加入22種氨基酸標準品的方法,每個樣品的添加濃度均為10 nmol/mL。分別重復6平行樣品。從表2中數據可以看出,兩種質控方法的回收率并無顯著差異,雖然使用標準樣校核相對方便,但含硫氨基酸Cys、Met的回收率明顯偏低,相對標準偏差較大。

表2 加標回收率和方法精密度Table 2 The average spiked recoveries and relative standard deviations

2.6 樣品中氨基酸的快速測定

通常市場上會在燕窩里摻雜膠原蛋白造假,但膠原蛋白中含有氨基酸Hyp和Sar,而燕窩中卻沒有,所以通過檢測是否存在Hyp和Sar,判定燕窩是否添加膠原蛋白。由表3可知,Hyp、Sar均為未檢出,證明10批次的燕窩中均沒有摻雜其他含膠原蛋白的物質。此外,所有被檢燕窩中均檢測出其他20種氨基酸,包括8種人體必需氨基酸,總氨基酸含量為76.7～92.5 g/100 g,必需氨基酸為18.4～23.4 g/100 g,必需氨基酸占總氨基酸的比例為22.7～26%。其中,含硫氨基酸Cys在單個氨基酸中的比例最高,與Warasri等[6]的實驗結果相符。因此可得,所測10批次燕窩中的氨基酸含量豐富、種類齊全,品質較佳,為實現燕窩的表皮生長因子樣活性、抗流感病毒、抑制凝血活性、改善骨強度和激素含量等生物活性提供物質基礎[24]。

10批次的燕窩22種氨基酸含量相對標準偏差在6.7～45.9%之間,表明各批次燕窩的氨基酸組成存在差異。由表3可知,Asn、Met、Trp和Ile等氨基酸的變異系數超過30%,因此,選擇這四種氨基酸來分析不同產地和品種的燕窩間氨基酸的差異。從產地分析,在所測燕窩樣品中,泰國的血燕、燕盞和馬來西亞的官燕碎總氨基酸含量較高,印尼的官燕碎總氨基酸含量較低,泰國和印尼的白燕碎中必需氨基酸含量較高。從品種來看,白燕碎的氨基酸含量略低。燕盞中Asn的高于其他品種的燕窩;馬來西亞和印尼的官燕碎中Met的偏低較多,馬來西亞的燕盞中Met含量較高;血燕中的Trp含量極低,其他品種燕窩均含有較高的Trp。樣本之間的差異可能是由燕子的品種、成熟度和物種之間的差異以及鳥類生活的地理位置和環境造成的[25]?？紤]到Tyr和Glu的含量差異被建議用作將住宅燕窩和洞穴燕窩區分開來[26],本文也能為燕窩來源的鑒定和產品的采購提供一定的參考,對氨基酸有特別要求的人群可以選擇性挑選燕窩品種和產地。

表3 不同產地10批次燕窩的氨基酸組成分析(n=2)Table 3 Amino acids composition of edible bird’s nest collected from various locations of 10 batches(n=2)

3 結論

本文基于在線衍生化反應機理,把自動在線衍生化(OPA-FMOC)與HPLC相結合,其中一級氨基酸用OPA、二級氨基酸用FMOC進行衍生,實現了快速和高靈敏度分析。兩種檢測器對22種氨基酸儀器方法進行比較,最終選用響應值高、分離效果好的FLD檢測器對氨基酸進行分析,整個方法分析過程快速、準確、靈敏且重現性好,適用于燕窩中氨基酸含量的檢測分析。重要的是,氨基酸Hyp和Sar的有無可作為判斷燕窩中有無摻雜豬皮等含有膠原蛋白的物質,氨基酸的組成比例和含量可作為燕窩是否摻假以及摻假多少的判斷依據之一。此外,燕子的品種、成熟度和物種之間的差異以及鳥類生活的地理位置和環境會造成燕窩中氨基酸的種類和含量的差異,Tyr和Glu的含量差異被建議用作將住宅燕窩和洞穴燕窩區分開來。本文也能為燕窩來源的鑒定和產品的采購提供一定的參考,對氨基酸有特別要求的人群可以選擇性挑選燕窩品種和產地。本文所測的十種燕窩中,都沒有摻雜含有膠原蛋白的物質,且氨基酸含量豐富,種類齊全,品質較佳。