宜春富硒溫泉中 產蛋白酶嗜熱菌株的篩選與鑒定

呂美云

(宜春學院化學與生物工程學院,江西宜春 336000)

目前,蛋白酶已廣泛應用于食品、藥品、洗滌劑及皮革等諸多工業領域[1]。而酶作為一類生物活性大分子具不穩定性,尤其在高溫、強酸、強堿和高滲等極端條件下更容易失活,限制了酶在工業上的應用[2]。高溫蛋白酶中的嗜熱蛋白酶具有對高溫、酸堿、有機溶劑、蛋白變性劑較穩定且有良好抗性,因此,高溫蛋白酶的研究和應用備受關注[3]。一般認為蛋白酶的熱穩定性與產酶菌株的生長溫度相關,產蛋白酶嗜熱菌株可從溫泉、火山口、深海熱泉等高溫環境獲得[4]。自1962 年對嗜熱菌蛋白酶報道以來[5],相繼從各地溫泉環境中篩選產蛋白酶嗜熱菌,以獲得熱穩定性較高的高溫蛋白酶。祝偉等[6]從騰沖熱海溫泉樣品中分離的1株高溫產蛋白酶菌株YMTC 1049,其生長溫度范圍為50～80 ℃。舒丹等[7]從西藏的尼木卡如林溫泉附近的土樣中分離出一株嗜熱堿性蛋白酶產生菌SD-142,其最適反應溫度為 60 ℃,最適pH為9.5,具有良好的pH穩定性和熱穩定性。張云峰等[8]從溫泉中分離出一株產嗜熱蛋白酶芽孢桿菌DPE7,當溫度為65 ℃,pH為9.0是最適宜的產酶條件。李楊霞等[9]從我國西南地區分別采取熱泉和地下熱水水樣,分離得到47株中度嗜熱菌,這些菌株在67或70 ℃時,可分泌多種耐熱的水解酶,其中 38%的菌株分泌蛋白酶。廉立慧[10]從徂徠山溫泉附近土樣中獲得產高溫蛋白酶菌株L7,其最適溫度為 55 ℃,最適pH10,并且具有良好的熱穩定性和pH穩定性。

宜春溫泉是國內罕見的富硒少硫的溫泉,位于江西省宜春市溫湯鎮,長年水溫達68 ℃,目前對其蛋白酶生產菌的資源研究與應用鮮有報導。本文以宜春溫泉溫湯古井水樣為樣品,用脫脂牛奶蛋白平板,55 ℃高溫培養的方法,篩選出產蛋白酶嗜熱菌株,并對其形態進行觀察、生理生化鑒定和生長特性的研究,以及菌株16S rRNA基因序列的分析,探究其種屬和系統進化關系,以期豐富產蛋白酶嗜熱菌資源,為產蛋白酶嗜熱菌的后繼研究和高溫蛋白酶的開發利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

實驗樣品 采自江西宜春溫湯古井水樣(溫度68 ℃,pH6.5～6.7),4 ℃保存;培養基 種子液培養基:牛肉膏0.3%、蛋白胨1%、NaCl 0.5%,pH7.2,121 ℃高溫滅菌30 min,斜面培養基加2%瓊脂;富集培養基:TYE 培養基[11];篩選培養基:TYE 培養基+底物(脫脂奶粉 黑龍江省完達山乳業股份有限公司);Ezup柱式細菌基因組提取試劑盒、即用PCR試劑盒 上海生工生物工程有限公司。

DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠;50BS-Ⅱ型生化培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;SW-CT-2D型雙人單面超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司;T100 Bio-Rad伯樂 PCR儀 美國Bio-Rad公司;BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像分析系統 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產蛋白酶嗜熱菌的篩選 用無菌過濾器濾過實驗水樣,將過濾的濾紙直接加入富集培養基,55 ℃搖床培養24 h。再將富集培養液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-55個梯度,選擇10-3、10-4、10-5三個梯度,取100 μL涂布于脫脂牛奶培養基上,每個梯度3個平行,置于55 ℃培養48 h。觀察菌落形狀、大小以及是否產透明圈。以不同菌落特征和有透明圈的菌株作為目標菌株進一步劃線分離。經過3次劃線分離純化單菌株,4 ℃保藏于斜面。測量不同菌株的透明圈直徑(D)和菌落直徑(d),根據D/d值作為菌株產蛋白酶能力強弱的初步判斷。

1.2.2 產蛋白酶嗜熱菌的生長特性的研究

1.2.2.1 菌體生長的最適溫度 將23株菌種按3%接種量接種于液體培養基中,培養溫度設置為25、35、45、55、65 ℃,150 r/min恒溫搖床培養48 h,測其OD600值,得出最適溫度。

1.2.2.2 菌體生長的最適pH 將液體培養基初始pH調至5、6、7、8、9,把23株菌種按3%接種量接種于液體培養基中,55 ℃,150 r/min恒溫搖床培養48 h,而后測其OD600值,得出最適pH。

1.2.3 產蛋白酶嗜熱菌株形態觀察和部分菌株生理生化鑒定

1.2.3.1 形態觀察 對純化的菌株進行形態觀察記錄和革蘭氏染色,鏡檢觀察。

1.2.3.2 生理生化鑒定 根據《常見細菌系統鑒定手冊》[12]對代表菌株進行生理生化鑒定,主要包括接觸酶、海藻酸鈉降解、硝酸鹽還原、甲基紅(M-R實驗)、V-P、檸檬酸鹽利用、酪素水解、淀粉水解、糖醇發酵(葡萄糖、乳糖、D-木糖、D-果糖、D-甘露糖、麥芽糖、L(+)-阿拉伯糖)、硫化氫、耐鹽(氯化鈉的梯度分別為2%、5%、7%、10%)、吲哚和Tween80降解實驗。

1.2.4 產蛋白酶嗜熱菌株的16S rRNA基因分子鑒定 用Ezup柱式細菌基因組提取試劑盒提取23株產蛋白酶嗜熱菌株DNA(具體方法見試劑盒使用說明書)。以總DNA為模板,采用文獻[13]中的細菌16S rDNA通用引物和50 μL反應體系進行PCR擴增。擴增條件:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性1 min;56 ℃退火溫度,復性45 s;72 ℃延伸1.5 min;共30個循環;最終72 ℃延伸10 min。擴增產物在電壓95 V,1.0%瓊脂糖凝膠下電泳。凝膠成像系統檢測PCR 擴增結果,送至上海生工生物工程有限公司進行測序。將測序并拼接的菌株16SrRNA基因序列提交GenBank中進行BLAS對比,利用MEGA6.0 中鄰接法(Neighbour-joining methods,NJ)構建進化樹,進化樹分支置信度采用Bootstrap法(支重復次數為1000)。

1.3 數據處理

三次測定數據采用Excel進行數據分析

2 結果與分析

2.1 產蛋白酶嗜熱菌的篩選與特征

通過富集和篩選,以產蛋白酶菌株在脫脂牛奶培養基可產生透明圈為依據,從宜春溫泉溫湯古井水樣中篩選到29株產蛋白酶菌株,編號為:N1～N29,根據D/d比值越大產蛋白酶能力越強,選取D/d值>1.0的23株產蛋白酶嗜熱菌菌株進行菌落形態觀察、革蘭氏染色和生長特性的研究,結果見表1。從表1中可見,大多數菌株的菌落特征呈現為濕潤、乳白、橢圓,均為革蘭氏染色陽性菌,在培養20 h內多數沒有產芽孢。這23株菌生長pH范圍為pH5.0～9.0,生長的溫度范圍較廣,為25～65 ℃,除N27外,其余菌株最適生長溫度為45～55 ℃,18株菌最高生長溫度在55～65 ℃,其中N2、N4、N10、N18、N19、N20在65 ℃能明顯生長,視為兼性嗜熱菌[14]。

表1 產蛋白酶嗜熱菌的篩選結果與特征Table 1 Screening results and characteristics of producing-protease thermophiles

2.2 生理生化特征

選取N2、N5、N9、N11、N17、N20為代表菌株進行生理生化鑒定,結果如表2所示,這6株代表菌株均不產氣,對海藻酸鈉實驗、M-R實驗、乳糖產酸實驗、吲哚實驗、Tween80 降解實驗均為陰性,接觸酶、葡萄糖產酸為陽性,可水解酪蛋白和淀粉(除N20不水解淀粉外),其余各項6株菌結果有差異,詳見表2。

表2 部分產蛋白酶嗜熱菌的生理生化結果Table 2 Physiological and biochemical results of the representative strains

2.3 16S rRNA的基因序列與系統發育分析

23株產蛋白酶嗜熱菌菌株,經過總DNA提取、PCR擴增,結果見圖1。由見圖1可見均獲得約1500 bp大小的目的片段,經雙向測序并拼接后,將各序列提交到NCBI上的GeneBank數據庫,獲得登錄號:KY433860-KY433881,經Blast比對,獲得23株產蛋白酶嗜熱菌菌株近緣種相似種屬(見表3)。

圖1 23株菌株16S rRNA基因的PCR電泳結果Fig.1 PCR results of 16S rRNA genes PCR amplified of 23 strains注:M為DL2000標準品;1～23泳道依次為 N2、3、4、5、8、9、10、11、13、14、15、17、 18、19、20、22、23、24、25、26、27、28、29菌株。

表3 23株菌株的同源性分析Table 3 Homology analysis of 23 strains

用MEGA6.0 中鄰接法(Neighbour-joining methods,NJ)構建系統進化樹如圖3,由Blast比對和系統進化樹可知23株產蛋白酶菌株可分別屬于厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)四個屬。N5、N27與Bacilluslicheniformis(CP014842.1)聚為一支,且與Bacilluslicheniformis同源性為99%,結合N5生理生化特征,可初步鑒定N5、N27為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。4株短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)中,N11雖另聚為一支,但在生理生化上與N17基本一致,且N4、N11、N14、N17與Brevibacillusborstelensis同源性很高,均100%,初步認為這4株菌為Brevibacillusborstelensis。厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)7株菌株與Anoxybacillusrupiensis同源性為99%,N9、N13、N18、N19、N28和Anoxybacillusrupiensis聚為一支,可以認為同一種,而N2、N12則與Anoxybacillusamylolyticus聚為一支,初步鑒定為Anoxybacillussp,其余10株與Aneurinibacillusthermoaerophilus同源性為99%,(除N8外)均與Aneurinibacillusthermoaerophilus聚為一支,可初步鑒定為嗜熱氣硫胺素芽孢桿菌(Aneurinibacillusthermoaerophilus),占全部篩選菌株總數的39.1%。N8與N11聚集為一支,其分類單元有待于進一步研究。

圖2 基于16SrRNA基因序列的產蛋白酶嗜熱菌菌株系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the Producing-protease thermophile based on 16S rRNA gene sequence

3 結論與討論

本文從富硒溫泉水樣中篩選到23株產蛋白酶嗜熱菌,這23株菌菌株生長pH范圍為5.0～9.0,生長的溫度范圍較廣,為25～65 ℃,除N27外,其余菌株最適生長溫度為45～55 ℃,18株菌最高生長溫度在55～65 ℃,其中N2、N4、N10、N18、N19、N20在65 ℃能明顯生長,可視為兼性嗜熱菌。通過生理生化和16S rRNA基因序列分析,結果表明,這些菌株分別屬于厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)4個屬。其中2株(N5、N27)為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。4株(N4、N11、N14、N17)為Brevibacillusborstelensis。7株厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)菌株中,N9、N13、N18、N19、N28初步鑒定為Anoxybacillusrupiensis,而N2、N12初步鑒定為Anoxybacillussp,剩余的10株(除N8外)均嗜熱氣硫胺素芽孢桿菌(Aneurinibacillusthermoaerophilus),占全部分離菌株總數的39.1%,為宜春富硒溫泉水樣中產蛋白酶嗜熱菌的優勢菌群。N8分類單元有待于進一步研究。

產蛋白酶嗜熱菌株多見于芽孢桿菌屬(Bacillus),已報導的有芽孢桿菌(Bacillussp. DPE_7)[8]、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)[15]、嗜熱芽孢桿菌(ThermophilicBacillus)[16]、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)[17],莫海威芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)[18]等,本文2株地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)為產蛋白酶嗜熱菌株,這與劉喚明[19]報導的一致。

目前國內外報道的高溫產蛋白酶的菌株中,短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)報道也不多,廉立慧[9]從徂徠山溫泉附近土樣中分離到一株產嗜熱蛋白酶的菌株L7,首次報道該菌株為Brevibacillus屬。龔志婷[20]報道騰沖溫泉產蛋白酶的菌株主要分布在Geobacillus、Brevibacillus及Aneburinibacillus三屬。本研究中篩選到4株Brevibacillus和9株Aneurinibacillus二屬,未見Geobacillus屬的產蛋白酶的嗜熱菌株。而本文還獲得7株Anoxybacillus屬的菌株,Anoxybacillussp.在2000年作為新的種屬首次報道[21],近年來,在我國云南騰沖溫泉土壤中相繼篩選到厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)產耐熱普魯蘭酶菌株Anoxybacillussp.LM 18-11[22]和產ɑ-淀粉酶的菌株Anoxybacillussp.GXS-3[23],國內還未見有溫泉環境中厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybacillus)產蛋白酶嗜熱菌的報道,可見宜春富硒溫泉有著豐富的產蛋白酶嗜熱菌資源,為高溫蛋白酶的開發和應用奠定基礎。