泡菜中對鉛有高吸附性的 乳酸菌的分離鑒定及特性研究

代啟虎,歐 杰,李 冉,李柏林

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306;2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306;3.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室,上海 201306)

環境中重金屬的污染越來越嚴重,有害重金屬一旦進入人體,在體內會形成蓄積物,難以被降解或排出,從而在機體器官富集,造成不可逆的損傷,對人體產生極大傷害。如日本水俁病、痛痛病以及我國的“鎘米”、“血鉛”等公共污染事件。鉛是一種對人體有害的重金屬,進入生物體后,Pb2+積累在腎臟和肝臟,引起腎、肝的損傷,破壞基本的細胞過程并且會影響神經系統[1-2]。

生物修復因其原料廣泛、成本低、操作簡單、環保,低濃度有較好的去除效果,在低濃度污染治理上也有較好的應用空間,而且不會產生次生危害等特點,成為現階段研究的熱點[3-4],目前主要用螯合物治療重金屬中毒,但治療的同時會有不良影響,對機體造成損傷、解毒不完全等弊端[5-6]。

乳酸菌是公認的安全級微生物,能夠耐受胃酸、膽汁和酶的能力。口服制劑可順利到達腸道,能夠改善機體機能,它對腸道調控、保護、修復的作用已經被證實[7]。隨著研究的不斷深入,有研究發現一些乳酸菌對重金屬有著良好的抗性和吸附性能,并且乳酸菌作為人體腸道內的有益菌群,對人體健康也有很好的保健作用[8]。于上富等[9]研究發現在鉛離子初始濃度為9.6 mg/L,加菌量4.2 g/L時德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)KLDS1.0207 鉛離子去除率高達95.17%。Halttunen[10]研究發現LactobacillusrhamnosusGG對鎘、鉛去除率分別為20.1%和60.1%,L.rhamnosusLC705對鎘、鉛去除率分別為30%和45%,BifidobacteriumbreveBbi99/E8對鎘、鉛去除率分別為40%和50%。

國內外將乳酸菌作為生物吸附劑的研究還是比較少的,大多數的乳酸菌吸附效率較低,并且大多數對重金屬有吸附性的乳酸菌用于食品或人體中還有待考量,而本實驗從泡菜中分離具有鉛抗性和高吸附性的乳酸菌,可以直接用于腌制泡菜、污水中重金屬的去除,并為動物體內鉛的去除奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MRS瓊脂培養基、MRS液體培養基sigma aldrich公司;泡菜 成都古味覺食品有限公司;乙酸鉛(AR)、鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉均為國產分析純 國藥集團化學試劑有限公司;銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色鏈珠菌(CanidiaAlbicans)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus) 上海魯微科技有限公司。

ZHJH-C1112C 超凈工作臺上海智城分析儀器制造有限公司;AUY120 電子分析天平日本島津公司;LRH-150F 生化培養箱上海一恒科技有限公司;YXQ-LX高壓蒸汽滅菌鍋上海博訊實業有限公司;PB-10 pH計德國賽多利斯股份公司;VITEK MS質譜儀法國生物梅里埃公司;ZWY-2102C搖床上海智城分析儀器制造有限公司;AA-7000火焰原子分光光度計日本島津公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐鉛菌株的分離及穩定性測定 稱取20.0 g泡菜于45 mL無菌生理鹽水中,37 ℃、150 r/min振蕩30 min后倍比稀釋到10-4,各取0.1 mL分別涂布于含有400 mg/L Pb2+的MRS固體平板上,37 ℃ 培養36 h時。根據菌落形態,挑取疑似乳酸菌菌落逐步在含有800、1200、1600、2000 mg/L Pb2+的MRS固體培養基上接種,37 ℃培養36 h時,在含2000 mg/L Pb2+條件下得到的菌株為目的菌株,并依次命名為p1、p2、p3…。將分離得到的單菌落菌株,接種到MRS斜面培養基中,在37 ℃的條件下培養24 h后放置4 ℃的冰箱保藏[11]。

將獲得的菌株在含Pb2+400 mg/L的MRS瓊脂培養基傳5～8代,根據菌株在培養基上的生長狀況判斷其穩定性。

1.2.2 耐性菌株的吸附鉛實驗 菌株接種于液體MRS培基中,37 ℃,150 r/min搖床培養2 d,離心收集菌體,用滅菌的去離子水洗滌2遍。稱取一定重量菌體(干重)加入到30 mL分別含30 mg/L和100 mg/L Pb2+的溶液中,使菌體濃度達到3 g/L,37 ℃,150 r/min搖床吸附48 h后,12000 r/min離心5 min,取上清用火焰原子分光光度計測吸光度并計算Pb2+的濃度[12]。菌株對鉛的吸附能力按下式計算:

式中:C0為最初鉛離子濃度,C為加菌處理后鉛離子濃度。

1.2.3 菌株的初步鑒定 將目的菌株接種于MRS平板上,37 ℃培養36 h,觀察菌落形態、進行革蘭氏染色,并選取主要的8種生化試劑對目的菌進行常規生化鑒定[13]。

1.2.4 菌株的質譜鑒定 挑取適量菌株于質譜儀樣品檢測板上,加0.5 μL 70%甲酸覆蓋菌株,隨后加1 μLα-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)溶液覆蓋。放置于室溫,干燥后,將檢測板放入質譜儀檢測。

儀器參數:LTB MNL 100 nitrogen laser激光器;激光頻率60 Hz,線性正離子(LP)采集模式;加速電壓2.10 kV,激發電壓20.00 kV,聚焦電壓6.00 kV,檢測電壓2.63 kV,質量范圍2000～20000 Da。每次實驗前用ATCC8739進行質譜儀的質量校正。將靶板送入MALDI-TOF-MS/MS 進樣倉,用Launchpad 2.9軟件進行質譜采集,并用SARAMIS 4.12分析軟件進行比對鑒定分析、聚類分析和主成分分析以及離子峰分析。

1.2.5 菌株的分子生物學鑒定 DNA的提取:用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株總DNA作為模板,選擇通用引物 27F:5′-AGTTTGA TCMTGGCTCAG-3′;1492R:5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′作為擴增引物,PCR反應體系見表1。

表1 PCR反應體系Table 1 PCR reaction system

PCR反應程序為:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳,用DNA回收試劑盒回收目的條帶,送上海生工生物科技公司測序,結果在NCBI中進行比對。

1.2.6 菌株生長特性研究

1.2.6.1 生長曲線的測定 接3%活化后的菌株于MRS液體培養基中,37 ℃,150 r/min搖床培養,不同時間取出,以空白培養基作為對照,測定OD600值,繪制菌株的生長曲線。

1.2.6.2 溫度對菌株生長的影響 接3%活化后的菌株于MRS液體培養基中,置于28、30、35、37、40 ℃的恒溫搖床中150 r/min培養,以空白培養基作為對照,培養24 h后,在600 nm處測定其OD值,繪制生長曲線。

1.2.6.2 鹽對菌株生長的影響 將活化好的菌株分別接種于含0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的NaCl的MRS液體培養基中,以不接菌的做空白對照,37 ℃、150r/min下搖床培養,36 h后,在600 nm處測定其OD值,繪制曲線。

1.2.6.3 番茄汁對菌株生長的影響 將活化好的菌株分別接種于含0、2%、4%、6%、8%、10%(v∶v)的番茄汁的MRS液體培養基中,以不接菌的做空白對照,37 ℃、150 r/min下搖床培養,36 h后,在600 nm處測定其OD值,繪制曲線。

1.2.6.4 酸耐受實驗 用HCl和NaOH將MRS液體培養基pH分別調至為1、2、3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9、10,滅菌后測初始接菌pH,將活化好的菌株分別接種于上述pH的MRS液體培養基中,以不接菌作為空白,37 ℃、150 r/min下搖床培養,36 h后,在600 nm處測定其OD值,繪制曲線。

1.2.6.5 膽鹽耐受實驗 將活化的菌株分別接種于含2.0、4.0、6.0、8.0 g/L膽鹽的MRS液體培養基中,以不加膽鹽的為空白對照,37 ℃培養36 h,稀釋適當的倍數后,涂布在MRS固體培養基上,培養24 h,觀察菌株的生長狀況并計數。

1.2.6.6 消化酶耐受實驗 將活化的菌株分別接種于含0.4、0.8、1.1 g/L胰蛋白酶的MRS液體培養基中,以MRS培養基為對照,37 ℃培養36 h,稀釋適當倍數后,涂布在MRS固體培養基上,培養24 h,觀察菌株的生長狀況,并計數。

1.2.6.7 抑菌實驗 參照文獻[14]用銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus、白色鏈珠菌(CanidiaAlbicans)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus),以無菌水作空白對照,測定菌株的抑菌性。

1.3 數據處理

實驗中每組實驗重復三次,用SPSS 23軟件進行顯著性分析,并用origin 85軟件做圖。

2 結果與分析

2.1 耐鉛菌株的分離及穩定性測定

通過菌株的篩選與分離,最終得到4株耐鉛菌株p1～p4,耐鉛濃度高達2000 mg/L。傳代多次,生長狀況無顯著變化,說明對鉛的耐性穩定。

2.2 菌株吸附鉛實驗

由圖1可知,在不同初始濃度(30和100 mg/L)的鉛溶液中,不同菌株對鉛吸附能力上差別很大,其中p3菌株在不同初始鉛濃度條件下,對鉛的吸附能力都是最強的,在100 mg/L的鉛溶液中,對鉛的吸附率達到78.90%±0.40%,具有研究價值。

圖1 菌株對鉛的吸附能力Fig.1 The adsorption ability of strains to lead 注:標有不同字母表示菌株間具有顯著性差異,p<0.05。

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌株的初步鑒定 p3菌株的菌落形態為乳白色圓形,菌落小,表面光滑。經革蘭式染色觀察,細胞成對或成鏈排列的革蘭式陽性菌,主要的生化鑒定結果如表2所示。結果表明p3菌株為乳桿菌屬。

表2 p3菌株的生化特性Table 2 Biochemical characteristics of p3 strain

2.3.2 菌株的質譜鑒定 p3菌株的質譜圖譜如圖4所示,用儀器配套軟件SARAMIS 4.12 將獲得的質量圖譜與標準菌株圖譜庫進行比對鑒定,與短乳桿菌相似度為96%,鑒定結果表明p3為短乳桿菌。

圖2 p3菌株的質譜圖譜Fig.2 Mass spectrum picture of p3 strain

2.3.3 菌株的分子生物學鑒定 將得到的菌株16S rDNA基因序列在NCBI上進行比對,選取相似度較高的模式菌株作為對比,

用MEGA5.0軟件構建系統發育樹,進行聚類性分析,得到的系統發育樹如圖3所示。由系統發育樹可知p3菌株與LactobacillusbrevisATCC 14869(T)親緣關系最接近,相似度在99.7% 以上,因此認定p3菌株為短乳桿菌。

圖3 菌株p3的16S rDNA序列系統發育樹Fig.3 Phylogenic tree of strain L4 based on 16S rDNA sequence

2.4 p3菌株生長特性研究

2.4.1 生長曲線測定結果 由圖4可知,該菌株在0～2 h處于延滯期,2 h后進入對數生長期,14 h進入穩定期,菌體含量基本達到最大。

圖4 菌株生長曲線Fig.4 The strain’s growth curve

2.4.2 溫度對菌株生長的影響 溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素之一,當溫度改變時,微生物生長繁殖也會受到影響。微生物的最適生長溫度可能是由溫度對生物體內無數個酶反應的綜合作用決定的。由圖5可知,隨著溫度的升高,菌體含量增大,且在35 ℃時,菌體含量達到最大,由此認為菌株的最適溫度為35 ℃,在隨著溫度升高,菌體含量降低。

圖5 溫度-OD值曲線Fig.5 Temperature-OD valuecurve

2.4.3 番茄汁濃度對菌株生長的影響 由圖6可知,隨著番茄汁濃度升高,菌體含量先增大后下降,當番茄汁濃度為2%時菌體含量最大。這是由于番茄汁中含有菌株的生長因子,促進了菌株的生長繁殖,由于每個試管液體總體積、初始MRS液體培養基的濃度一定,及隨著番茄汁濃度的升高,降低了MRS液體培養基的濃度,從而減少了菌體濃度。

圖6 番茄汁含量-OD值曲線Fig.6 Tomato juice concentration-OD value curve

2.4.4 酸耐受實驗 由圖7可知,菌株在不同的初始pH環境中培養36h后,菌體含量差異很大,該菌株在pH4～8范圍時,生長較好。隨著pH的升高,菌濃度逐漸增大,在pH為6.5時,達到最大,之后隨pH升高而降低,因此可以認為菌株的最適pH為6.5。pH對乳酸菌的生長影響很大,這是因為細胞膜通透性受其影響,從而影響菌株對營養物質的吸收。

圖7 pH-OD值曲線Fig.7 pH-OD value curve

2.4.5 鹽耐受實驗 由圖8可知:菌株在含不同的鹽濃度MRS液體培養基中培養36 h后,菌體含量差異較大,當含鹽量為0% 時,菌體含量最大,且隨鹽濃度升高,菌體含量下降。鹽濃度在0%～5%時,菌株生長較好。這是由于隨鹽濃度升高,引起滲透壓增大,使細胞內水分外流,細胞胞質分離,對細胞結構和生理上造成損傷,導致細胞停止生長,當達到一定濃度時,甚至造成死亡。由于該菌株是從泡菜中分離得到的,所以比大多數從其它樣品中分離得到的乳酸菌具有更高的鹽耐受性,李洪淼等[15]從泡菜中分離出的4株乳酸菌在鹽度為6%時基本不生長。

圖8 鹽濃度-OD值曲線Fig.8 Salt concentration-OD value curve

2.4.6 膽鹽耐受實驗 由圖9可知,隨著膽鹽濃度升高,活菌數逐漸減少,在膽鹽濃度達8 g/L時仍生長良好,及菌株能在一定濃度的膽鹽條件下生長,人體小腸膽鹽濃度一般在3 g/L以下,及該菌株可以很好的存在于小腸內。該結果比劉宏宇等[16]測得10株乳酸菌具有更高的耐膽鹽性,這10株菌的耐膽鹽性僅有5 g/L。

圖9 不同膽鹽濃度下活菌數變化Fig.9 The change of live bacteria number under different bile salt concentration

2.4.7 消化酶耐受實驗 由圖10可知與對照組相比,結果表明,該菌株在含1.1 g/L胰蛋白酶的MRS培養基中生長良好,及菌株能在一定濃度的胰蛋白酶條件下生長。并且該菌株耐胰蛋白酶性比夏爽等[17]分離的20株耐胰蛋白酶的菌株具有更高的耐胰蛋白酶性,這20株菌的耐耐胰蛋白酶性僅有1 g/L。

圖10 不同胰蛋白濃度下活菌數變化Fig.10 The change of viable count under different trypsin concentration

2.4.8 抑菌實驗 由表3可知,菌株對枯草芽孢桿菌、菌株對銅綠假單胞菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌均有一定的抑制性,其中對銅綠假單胞菌的抑制效果最好。

表3 菌株抑菌性Table 3 Antimicrobial activity

3 結論與討論

利用微生物去除重金屬已經成為研究熱點,與傳統方法相比,微生物去除重金屬具有成本低廉、來源廣、吸附速度快、吸附量大等特點。已經有從動物腸道、土壤、食品等材料中分離乳酸菌的報道,但是從泡菜中分離篩選乳酸菌清除重金屬的研究較少。

本實驗從泡菜中篩選出一株對鉛具有高耐受性和吸附性的p3菌株,對鉛的耐受性達2000 mg/L,對鉛的吸附率高達78.90%。通過形態、生理生化特征,質譜鑒定及16S rDNA序列測定,鑒定結果p3菌株為短乳桿菌。該菌株在含鹽0～5% 時生長良好,能耐受pH為2的酸、8 g/L膽鹽和1.1 g/L的胰蛋白酶,在pH初值為6.5,溫度為35 ℃,番茄汁濃度為2%時菌體濃度最大。

短乳桿菌分布廣泛,在泡菜中特別常見,在消化系統中小腸含量最多。研究和報道表明,短乳桿菌具有高產酸、解毒、抑菌和提高機體免疫力等多種生理功效[18-21]近年來已逐漸被廣泛的應用在食品生產、飼料加工、水產養殖以及畜禽疾病防治等方面[22-26]。而對鉛有高耐受性和高吸附性的短乳桿菌尚未見到報道。本實驗篩出的短乳桿菌對不僅對鉛具有高耐受性和高吸附性,對酸、鹽、膽鹽以及胰蛋白酶都有一定耐受性,并且對銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及蠟狀芽孢桿菌都有抑制作用。