知母多糖對鏈脲佐菌素 誘導糖尿病大鼠的降血糖作用

侯紅瑞,陳 玲,孫國勇,李炳輝

(1.茂名職業技術學院,廣東茂名 525000;2.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640)

糖尿病是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病群,高血糖由于胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗引起,長期慢性高血糖誘發脂肪和蛋白代謝紊亂,繼而引起一系列視網膜、腎臟、神經、心血管系統的并發癥,對人類健康、壽命和生活質量構成嚴重威脅[1]。雖然臨床治療藥物種類不少,但大多為化學藥物(西藥)[2]。西藥在控制血糖方面療效值得肯定,但長期使用存在許多副作用,如惡心、厭食、肝腎損傷等,且價格昂貴。中醫治療糖尿病也有相當長的歷史,傳統中醫把糖尿病稱作“消渴癥”,《黃帝內經》及《金匱要略》就有關于糖尿病發病癥狀及機理的記載[3]。中藥對于改善機體狀況,減輕發病癥狀,尤其在治療糖尿病并發癥方面有著穩定的療效,并且與西藥相比,作用溫和持久,毒性和不良反應少[4]。因此研究和開發具有良好療效的中藥降血糖產品具有廣闊的發展前景。

知母為百合科植物知母[AnemarrhenaasphodeloidesBge.(AA)]的干燥根莖,具有清熱瀉火、生津潤燥,止渴除煩等功效[5],有悠久的降血糖應用歷史,從傳統治療糖尿病的中藥方劑“玉液湯”到現代中成藥人知降糖膠囊、降糖舒膠囊等均含有知母。知母化學成分多樣而復雜,目前發現的有皂昔、雙苯吡酮類、多糖類、有機酸類等[6-9]。研究表明知母中的皂昔、多糖均具有抗糖尿病的作用[10-11],尤其是知母多糖在降血糖和抗氧化性方面效果顯著。目前已有相關文獻報道,但是目前文獻研究知母多糖降血糖的報道中知母多糖均是水提、醇提或醇沉法制備而得,所得知母多糖成分復雜、純度低,其抗氧化及降血糖的有效部位較模糊[12-14]。

本文對知母根莖水提、醇沉,得到知母粗多糖后,除去蛋白質,再利用無機陶瓷膜進行膜分離得到分子量為30～100 kDa的知母多糖。本課題組前期對該知母多糖進行生物活性研究中發現,其具有良好的體外抗氧化性尤其在清除·OH方面效果突出,并對胰島素受體和底物磷酸化水平起負調控作用的蛋白絡氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)活性有很高抑制率(達69.39%)[15]。為進一步深入探討分子量為30～100 kDa知母多糖的藥效物質基礎及降血糖作用機制,本文用鏈脲佐菌素(STZ)誘導建立實驗性SD大鼠糖尿病模型[16],研究該知母多糖對STZ型糖尿病SD大鼠降血糖、降血脂效果,為知母深層次藥用開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

知母 購自廣州致信中藥飲片廠,產地河北,批號081101,為知母根莖切片;鏈脲佐菌素(AR) 美國Sigma公司;二甲雙胍片 河北天成藥業有限公司;總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒 中生北控生物科技有限公司;胰島素測定試劑盒 美國ADL公司。

ALPHA2-4真空冷凍干燥機 德國Christ公司;Labscale超濾系統 美國Milipore公司;3K30超速冷凍離心機 德國Sigma公司;BX51TRF熒光顯微鏡 日本Olympus公司;血糖測定儀(穩豪倍易型) 美國強生公司。

SPF級SD大鼠 40只,雄性,體重130±3克/只,由廣東省醫學動物實驗中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 知母多糖的提取分離 知母根莖切片后在沸水中提取4 h,提取3 次,收集提取液,減壓濃縮至適當體積后加4 倍體積無水乙醇放置過夜,4000 r/min離心,真空冷凍干燥得知母多糖粗提物,4 ℃密封干燥保存備用。

配制5%的知母多糖粗提液置于-20 ℃冰箱中冷凍過夜后室溫緩慢融化,高速離心(8000 r/min)重復4次,直至沒有殘渣,用Sevage法去除蛋白至無游離蛋白為止,Sevage法去除蛋白后的知母多糖在室溫,0.2 MPa壓力下經0.3 μm孔徑的無機陶瓷膜微濾[17]。所得濾液在0.35 MPa壓力下用30、100 kDa的膜包進行膜分離,收集分子量為30～100 kDa知母多糖組分,采用苯酚-硫酸法[18]測得分子量介于3～100 kDa的組分中知母多糖含量占總組分質量的75%。

1.2.2 STZ型糖尿病SD大鼠動物模型的建立 將40只SD大鼠分成4 組,10 只/組,在動物房內溫度為22 ℃和相對濕度為60%的條件下飼養。大鼠適應環境3 d后對大鼠進行糖尿病造模。STZ用0.1 mol/L,pH4.5的檸檬酸鈉緩沖液新鮮配制。大鼠禁食不禁水12 h之后,STZ 90 mg/kg給大鼠尾靜脈一次注射造模。恢復進食72 h后尾靜脈取血測血糖,以血糖值在16～24 mmol/L的大鼠為成模動物[19]。根據成模的血糖值將大鼠隨機分成三組,每組10 只,分別為高血糖模型組、二甲雙胍組、知母多糖組。隨機取10 只未造模正常大鼠作為正常對照組。正常對照組及模型組均灌胃給予等量生理鹽水,二甲雙胍組灌胃給予二甲雙胍300 mg/kg,知母多糖組灌胃給予知母多糖300 mg/kg,每天給藥1次,連續給藥4周。

1.2.3 實驗指標測定 連續給藥4周,每周末禁食不禁水12 h,稱重后,取尾部靜脈血測量空腹血糖,并根據公式(1)計算血糖抑制率。給藥4周后,禁食不禁水12 h,頸椎脫臼處死大鼠采血2 mL,3000 r/min離心分離血清,用試劑盒測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C),低密度脂蛋白膽固醇(LDC-C)。采用放射性免疫法測定血清胰島素(FINS),根據公式(2)計算胰島素抵抗指數(IRI)[20],用以評價外周胰島素的抵抗程度。

血糖抑制率(%)=(給藥前空腹血糖值-給藥后空腹)/給藥前空腹血糖值

式(1)

式(2)

1.2.4 糖尿病SD大鼠胰腺病理組織學觀察 頸椎脫臼處死大鼠后,迅速摘取完整的胰腺組織,置于冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液并仔細分離多余的脂肪組織。取相同部位的胰腺組織,放入10%的中性福爾馬林溶液固定,每例均進行蘇木素-伊紅(HE)染色和石蠟包埋,切片在光學顯微鏡下觀察[21]。

1.3 統計學處理

2 結果與分析

2.1 知母多糖對糖尿病SD大鼠體重的影響

由表1可知,給藥前各組SD大鼠體重無顯著差異(p>0.05);給藥第4周,與正常對照組比較,模型組的SD大鼠體重極顯著下降(p<0.01),表現出糖尿病的明顯特征。二甲雙胍組在給藥后的前2周體重出現持續下降,給藥3周之后體重開始恢復,與模型組比較有極顯著差異(p<0.01),說明降血糖藥物有減輕糖尿病SD大鼠消瘦癥狀的作用。知母多糖組的SD大鼠體重在前3周也出現逐漸下降的趨勢,與模型組比較,下降趨勢緩慢,給藥3周后有顯著差異(p<0.05),經4周治療后,體重恢復至造模開始時體重。表明,知母多糖能減緩糖尿病SD大鼠體重負增長趨勢,促進SD大鼠體重正增長,對糖尿病SD大鼠體重下降有一定的緩解作用。

表1 各實驗組SD大鼠體重的變化Table 1 The body weight change of SD rats from each

2.2 知母多糖對糖尿病SD大鼠空腹血糖的影響

造模成功后的SD大鼠空腹血糖值與正常組相比,極顯著高于正常值(p<0.01),4 周給藥期間,模型組的血糖值較為穩定,沒有出現自我恢復的現象,二甲雙胍組和知母多糖組SD大鼠的空腹血糖值均顯著下降,與模型組比較差異極顯著(p<0.01),結果見表2。4周給藥后,二甲雙胍組血糖值逐漸降低至大鼠正常水平(<7.5 mmol/L),血糖抑制率達到69.3%,說明二甲雙胍處理對糖尿病SD大鼠血糖有很好的控制作用;知母多糖組SD大鼠的血糖值呈逐漸下降趨勢,降低程度較二甲雙胍組有所減緩,至4周后降低至接近大鼠正常血糖水平,與模型組相比有極顯著差異(p<0.01),血糖抑制率達到62.4%,略低于二甲雙胍組。說明知母多糖對STZ誘導的糖尿病大鼠具有較好的降血糖效果。

表2 知母多糖對STZ致糖尿病SD大鼠空腹血糖的影響Table 2 Effects of AM on FBG of streptozotocin-induced diabetic

2.3 知母多糖對糖尿病SD大鼠血脂的影響

灌胃4周后,取血清測總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。結果見表3。

表3 知母多糖對STZ致糖尿病SD大鼠血脂的影響Table 3 Effects of AM on blood-lipid of streptozotocin-induced diabetic

由表3可看出,與正常對照組比較,模型組的TC、TG、LDL-C含量均高于正常對照組,HDL-C低于正常對照組,且存在極顯著性差異(p<0.01),血清TG、TC含量是判定高血脂癥的重要指標,說明STZ致糖尿病SD大鼠出現脂代謝紊亂,有高血脂表現。給藥4周后,知母多糖組SD大鼠血清中的TC水平與模型組相比極顯著降低(p<0.01),TG水平顯著降低(p<0.05),說明知母多糖具有降低血清TC、TG水平的作用。有研究表明,HDL-C含量越低,則冠心病的發病率越高,是冠心病的負危險因素[22]。與模型組比較,知母多糖組SD大鼠血清中的HDL-C水平極顯著升高(p<0.01),LDL-C水平極顯著降低(p<0.01),說明知母多糖具有升高HDL-C水平,降低LDL-C水平的作用。二甲雙胍組與模型組比較,SD大鼠血清中的TG水平未降低反而極顯著升高(p<0.01),TC、HDL-C、LDL-C指標無顯著差異(p>0.05)。表明知母多糖可降低糖尿病SD大鼠的總膽固醇(TC)和甘油三脂(TG),升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C),降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),對STZ致糖尿病引起的高血脂癥有預防及治療作用。

2.4 知母多糖對糖尿病SD大鼠空腹胰島素的影響

胰島素是人體胰腺β細胞分泌的調節體內糖代謝的內分泌激素,也是身體內主要的降血糖激素。胰島素抵抗是胰島素作用的器官、組織,如肝臟、肌肉、脂肪等體內周圍組織對胰島素的敏感性降低,對胰島素不敏感,反應性降低或消失,外周組織如肌肉、脂肪對胰島素促進葡萄糖攝取的作用發生了抵抗,從而引起一系列病理變化與臨床疾病。降低患者的胰島素抵抗,改善胰島素敏感性,可延緩糖尿病發展。

從表4可以看出,STZ致糖尿病SD大鼠模型組與正常對照組相比胰島素水平顯著升高(p<0.05),且胰島素抵抗指數(IRI)極顯著升高(p<0.01),出現明顯胰島素抵抗。給藥4周后,與模型組比較,二甲雙胍組和知母多糖組SD大鼠血清胰島素顯著降低(p<0.05),IRI極顯著降低(p<0.01),胰島素抵抗明顯改善。說明知母多糖能有效改善STZ致糖尿病SD大鼠的胰島素抵抗,且效果與二甲雙胍相當,通過改善胰島素抵抗,實現對胰腺β細胞功能的保護來治療糖尿病。

表4 知母多糖對STZ致糖尿病SD 大鼠胰島素的影響Table 4 Effects of AM on FINs of streptozotocin-induced diabetic

2.5 知母多糖對糖尿病SD大鼠胰腺組織學的影響

如圖1所示,對胰腺組織形態的觀察結果表明,正常對照組胰島為圓形或橢圓形的細胞團,細胞核大小均勻,分散于胰腺腺泡之間,胰島中細胞數量較多,細胞分布均勻,排列規整,結構清晰,與周圍胰腺組織邊界清晰可辨。模型組胰島結構紊亂,形態不規則,組織疏松,外分泌腺邊界不太清晰,胰島內分泌細胞分布不均,細胞數目減少。知母多糖組胰島結構較清晰,邊緣整齊,細胞分布比較均勻,組織緊湊,胰島細胞數目相對于模型組增多但仍顯著少于正常對照組。說明知母多糖可改善糖尿病大鼠胰腺萎縮情況,減輕STZ對SD大鼠胰島細胞的選擇性損傷,對糖尿病大鼠胰腺有較好的保護,并能增加胰島細胞數量、提高胰島細胞功能。

圖1 知母多糖對STZ致糖尿病SD 大鼠胰島組織形態影響(×50)Fig.1 Effect of AM on the islet morphology of streptozotocin-induced diabetic rats (hematoxylin-eosin stain,×50)注:a.正常對照組;b.高血糖模型組;c.知母多糖組。

3 結論

本文采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導建立實驗性SD大鼠糖尿病模型,探究分子量30～100 kDa知母多糖組分的降血糖機制。結果表明,給藥治療4周后,與模型組相比,分子量30～100 kDa知母多糖可有效地降低糖尿病SD大鼠血糖值,血糖抑制率達到62.4%,且SD大鼠體重呈現升高趨勢;糖尿病SD大鼠血清中的TC、TG、LDL-C含量降低,HDL-C含量升高,改善了糖尿病SD大鼠脂代謝紊亂;可顯著降低SD大鼠血清胰島素和IRI,對胰島素抵抗改善明顯;HE染色觀察后發現知母多糖可減輕STZ對SD大鼠胰島細胞的選擇性損傷,對被特異性破壞后胰島細胞有修復作用。結合本課題組前期對分子量30～100 kDa知母多糖組分在體外抗氧化和抑制PTP-1B活性的能力研究[15]可知,知母多糖的降血糖作用主要是通過提高抗氧化能力、改善胰島素抵抗和修復受損胰島細胞組織,實現對胰腺β細胞功能保護,刺激胰島細胞增加胰島素的分泌,提高外周組織對胰島素的敏感性,從而起到降低血糖的作用。